Analisi di Carotenoidi e Vitamine Liposolubili in Alimenti di Origine Vegetale Tramite Matrix Solid Phase Dispersion Seguita da Cromatografia Liquida con Rivelazione DAD-Tandem MS

Le vitamine liposolubili costituiscono un insieme eterogeneo di sostanze, classificabili in 4 gruppi: A (retinoidi e carotenoidi), D [ergocalciferolo (D2) e colecalciferolo (D3)], E (alfa-, beta-, gamma-, delta-tocoferoli e corrispondenti tocotrienoli), e K [fillochinone (K1) e menachinoni (K2-n)]. Le principali funzioni biologiche cui tali vitamine partecipano sono il meccanismo di visione (vitamina A), l’assorbimento del calcio (vitamina D), la protezione antiossidante delle membrane cellulari (vitamina E e carotenoidi) e la coagulazione del sangue (vitamina K). La determinazione delle vitamine liposolubili e dei carotenoidi negli alimenti rappresenta un complesso problema analitico per diverse ragioni quali: 1) l’eterogeneità chimica che richiede specifici parametri di rivelazione; 2) la presenza di vitameri, isomeri geometrici e forme legate (xantofille e retinolo possono essere naturalmente presenti come esteri) difficili da separare ed identificare a causa di indisponibilità degli standard; 3) la diversa e scarsa stabilità degli analiti alla luce, all’ossigeno e alla temperatura, il legame con altri componenti dell’alimento (proteine, polisaccaridi e grassi) e la complessità stessa della matrice, tutti fattori che rendono critico lo step di estrazione. Una soluzione spesso adottata è quella di liberare tutte le forme legate o mediante idrolisi alcalina (specialmente per alimenti con alto tenore lipidico) che tuttavia è responsabile della rapida decomposizione dei vitameri K, di una severa perdita di xantofille, dell’isomerizzazione del beta-carotene all-trans e della vitamina D, o mediante digestione enzimatica (proteasi, takadistasi, lipasi) per le vitamine più labili. Attualmente, le procedure ufficiali si basano sulla determinazione individuale di ogni vitamina nei diversi alimenti, principalmente usando tecniche HPLC con rivelazione UV o a fluorescenza, abbinate a procedure estrattive quantitative e non distruttive. Pochi sono i metodi analitici proposti per la determinazione simultanea di vitamine liposolubili negli alimenti basati su tecniche cromatografiche. Tra i metodi multivitaminici finora pubblicati, solo due sono basati sulla cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS): il primo limitato alla determinazione di retinolo, alfa-tocoferolo e colecalciferolo in alimenti fortificati per l’infanzia, l’altro per l’analisi di diverse vitamine liposolubili (retinolo, D2, D3, 25-OH-D3, beta-carotene, K1, MK-4 e MK-7) nel latte materno, adottando però una procedura di estrazione separata per i vitameri K. Per quanto riguarda l’analisi dei carotenoidi nella frutta, la letteratura descrive alcuni metodi LC-DAD-MS, intendendo questa tecnica ifenata anche come strumento d’ausilio nell’individuazione di sofisticazioni alimentari. Lo scopo principale di questo lavoro è stato dunque quello di sviluppare un metodo LC-DAD-Tandem MS per la determinazione simultanea di dodici composti appartenenti al gruppo delle vitamine liposolubili (retinolo, retinil palmitato, gamma-tocoferolo, alfa-tocoferolo, delta-tocoferolo, ergocalciferolo, fillochinone e menachinone-4) e dei carotenoidi (luteina, zeaxantina, beta-carotene e licopene) in alcune matrici alimentari di origine vegetale (farina di mais, passata di pomodoro kiwi verde e kiwi gold). La fase di estrazione/clean-up è stata realizzata applicando una tecnica “mild” come la Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD), con piccole modifiche operative a seconda della matrice trattata. Gli analiti erano separati su colonna analitica C30 ed inequivocabilmente rivelati ed identificati mediante uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo, equipaggiato con una sorgente APCI, operante in ionizzazione positiva. L’accoppiamento in serie con un detector UV-vis a serie di diodi permetteva di caratterizzare rapidamente il profilo carotenoideo e vitaminico degli alimenti analizzati, consentendo l’identificazione di quei carotenoidi i cui standard non erano commercialmente disponibili. L’applicazione ai campioni reali ha portato a risultati interessanti quali: la presenza di vitamina K2 (menachinone-4) in alimenti di origine vegetale; l’identificazione di isomeri geometrici naturali non originati dalla procedura estrattiva applicata, anche se nel caso della passata di pomodoro il processo di pastorizzazione potrebbe interferire con la naturale distribuzione del licopene