Optimasi dan Validasi Metode Deteksi Cemaran Babi pada Produk Olahan Daging dengan Menggunakan Teknik Direct Real-Time PCR

Indonesia merupakan negara dengan mayoritas penduduk beragam Islam. Tingginya jumlah penduduk beragama Islam, menjadikan penjaminan halal produk penting untuk dilakukan. Salah satu bentuk penjaminan halal produk yaitu diberikannya sertifikat halal dalam label kemasan. Namun, jumlah produk di Indonesia yang telah mendapatkan sertifikat halal sedikit, sedangkan Lembaga Pemerika Halal (LPH) yang telah terakreditasi berjumlah 11. Berdasarkan UU no. 33 Tahun 2014, per Oktober 2019 semua produk pangan harus memiliki sertifikat halal. Oleh karena itu, dibutuhkan metode deteksi halal yang lebih singkat dan akurat yaitu dengan menggunakan teknik direct Real-Time PCR. Penelitian ini bertujuan mengoptimasi dan memvalidasi metode pengujian deteksi cemaran babi dengan teknik direct Real-Time PCR agar dapat digunakan pada laboratorium pengujian halal di setiap LPH. Penelitian dibagi menjadi tiga tahapan. Tahap pertama yaitu optimasi proses ektraksi DNA. Kegiatan ini meliputi rasio berat sampel dan volume buffer lisis serta optimasi suhu dan lama inkubasi lisis terhadap kemurnian dan konsentrasi DNA dengan menggunakan daging babi dan celeng sebagai kontrol positif. Selain itu, dilakukan penentuan suhu annealing, konsentrasi primer, dan DNA yang tepat. Suhu annealing yang digunakan 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, dan 55°C. Konsentrasi primer yang digunakan 10, 7.5 dan 5 pmol. Sedangkan, konsentrasi DNA yang digunakan yaitu 100, 50, 25 dan 1 ng/μl. Nilai Ct terendah merupakan konsentrasi DNA, primer dan suhu annealing terbaik. Kemudian diakukan validasi metode dengan menggunakan enam parameter antara lain uji applicability (10 produk olahan daging babi diekstrak dan dihitung kemurnian dan konsentrasi DNA serta nilai Ct), uji repeatability (dilakukan 7 ulangan pengujian proses amplifikasi oleh satu analis), uji reproducibility (dilakukan pengujian menggunakan Real-Time PCR dengan sampel kontrol positif dan negatif oleh tiga analis), uji LoD (dilakukan amplifikasi dengan menggunakan serial pengenceran 10-10-10 ng/μl), uji spesifisitas primer ND4 terhadap DNA target, dan uji ketahanan terhadap inhibitor. Metode yang telah dioptimasi dan divalidasi, digunakan untuk sampling pada beberapa produk olahan daging di 19 pasar dan supermarket yang ada di Kota Malang. Hasil penelitian menunjukkan perlakuan terbaik untuk proses ekstraksi DNA dengan menggunakan metode buffer lisis yaitu pada suhu 75°C selama 25 menit dengan menggunakan berat sampel 5 mg dan volume buffer lisis 200 μl. Sedangkan proses amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR terbaik dilakukan dengan menggunakan 50 ng/μl DNA, konsentrasi primer 10 pmol dan suhu annealing 53°C. Metode ini memiliki presisi yang tinggi dengan ditunjukkan nilai RSDr 1.06% dan nilai RSDR sebesar 1.57%. Selain itu, metode ini dapat mendeteksi DNA target (babi dan celeng) dengan menggunakan primer NADH Dehydrogenase subunit 4 (ND4) dengan sensitivitas yang tinggi yaitu 10-3 ng/μl. Inhibitor (alginat, ion kalsium, EDTA dan selulosa) tidak berpengaruh nyata terhadap proses amplifikasi Real-Time PCR kecuali polisakarida. Metode ini dapat mengekstrak delapan produk olahan daging (sosis, permen, abon, ham, kornet, kerupuk, bakso, dan dendeng) dan tidak dapat mengekstrak sampel kaldu dan siomai. Oleh karena itu, metode direct Real-Time PCR dapat digunakan sebagai alternatif pengujian deteksi babi pada produk olahan daging