Optimasi Suhu dan Waktu Inkubasi dalam Proses Isolasi DNA Metode direct-PCR untuk Deteksi Kandungan DNA Tikus (Rattus norvegicus) Menggunakan Primer Spesifik 12S rRNA Metode Real-time PCR

Meningkatnya kesadaran masyarakat terhadap makanan halal menyebabkan semakin tingginya tuntutan terhadap makanan yang bersertifikat halal. Berdasarkan aspek agama dan kesehatan, identifikasi jenis daging untuk keaslian makanan berbahan dasar daging sangat penting tidak hanya bagi konsumen tetapi juga bagi regulator dan produsen. Pemalsuan daging sapi dengan daging tikus kerap dilakukan oleh produsen bertujuan untuk menekan biaya produksi dan menjual dengan harga yang lebih terjangkau untuk mendapatkan keuntungan ekonomi yang lebih. Telah dilakukan metode deteksi cepat spesies daging dengan teknik direct-PCR dan amplifikasi menggunakan PCR konvensional. Namun, PCR konvensional membutuhkan tahap yang panjang dan memakan banyak waktu. Dengan demikian, pada penelitian ini akan dilakukan metode deteksi cepat spesies daging tikus dengan teknik isolasi DNA direct-PCR dan amplifikasi menggunakan Real-time PCR. Mesin Real-time PCR dinilai lebih cepat jika dibandingkan dengan PCR konvensional. Sampel daging tikus yang digunakan berasal dari tikus spesies Rattus norvegicus karena spesies ini merupakan golongan tikus domestik yang populasinya banyak berada di area pemukiman manusia, sehingga dianggap sebagai hama dan kerap ditangkap. Metode isolasi DNA yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode direct-PCR, yaitu metode isolasi DNA tanpa proses pemurnian DNA yang panjang sehingga tidak memakan banyak waktu. Dilakukan optimasi suhu dan waktu inkubasi pada proses isolasi DNA dari daging tikus untuk menentukan suhu dan waktu optimum inkubasi dalam mendapatkan DNA dengan jumlah yang paling banyak sehingga pada amplifikasi dapat memunculkan nilai Ct yang rendah. Dilakukan uji validasi yang meliputi uji spesifisitas dan uji Limit of Detection (LoD). Uji spesifisitas untuk mengetahui kesesuaian primer 12S rRNA yang digunakan terhadap spesies tikus. Sedangkan uji LoD untuk mengetahui batas konsentrasi DNA terendah yang dapat dideteksi oleh metode yang digunakan. Hasil dari peneltian ini didapatkan suhu dan waktu inkubasi paling optimal adalah suhu 85°C dan waktu 25 menit karena menghasilkan nilai konsentrasi DNA paling tinggi dibandingkan dengan variasi suhu dan waktu lainnya, yaitu sebesar 459,56 ng/μL. Hasil amplifikasinya juga memunculkan nilai Ct yang paling konstan pada tiga kali ulangan yaitu 23,28; 26,38; dan 20,29. Primer 12S rRNA yang digunakan spesifik terhadap spesies daging tikus, ditunjukkan dengan munculnya nilai Ct sebesar 19,375 pada sampel daging tikus sedangkan pada sampel spesies lain tidak memunculkan nilai Ct. Metode yang digunakan memiliki sensitivitas mendeteksi DNA tikus hingga konsentrasi 5 × 10-4 ng/μL sebagai nilai LoD pada penelitian ini