Structural and functional studies of the acetylcholinesterase ChoE from Pseudomonas aeruginosa

L'acétylcholine (ACh), bien connue comme neurotransmetteur chez les animaux, est le substrat des acétylcholinestérases eucaryotes et procaryotes (AChE). La structure et la fonction des AChE de mammifères ont été bien étudiées en raison de leur importance à la fois dans les synapses cérébrales cholinergiques, dans le système nerveux périphérique et également comme une cible médicamenteuse clé pour de nombreuses maladies telles que la maladie d'Alzheimer chez les humains. En revanche, les acétylcholinestérases procaryotes restent mal comprises malgré une longue historique d'études. La bactérie Pseudomonas aeruginosa possède le système d'acquisition de la choline comprenant l'enzyme ChoE, qui aide à importer la choline comme source de nutriments. Fait intéressant, ChoE a été identifiée comme une acétylcholinestérase putative qui présente des propriétés enzymatiques similaires aux AChE de mammifères malgré sa taille beaucoup plus petite. Dans ce travail, pour mieux comprendre l'acétylcholinestérase d'origine procaryote, nous avons effectué la caractérisation structurale et biochimique de ChoE en utilisant la cristallographie aux rayons X et l'enzymologie comme approches primaires. Nous avons démontré que ChoE est indispensable à la croissance de P. aeruginosa lorsque l'acétylcholine est utilisée comme seule source de carbone et d'azote. Un ensemble complet de structures à haute résolution de ChoE a été obtenu, y compris des complexes avec des substrats, des produits, un intermédiaire acyle ainsi qu'un inhibiteur. Ces structures ont révélé les déterminants moléculaires de la reconnaissance du substrat, des instantanés des différentes étapes catalytiques et la base moléculaire de l'inhibition du substrat à des concentrations élevées de substrat. D'après ces résultats, la libération retardée du produit acétate facilite la liaison non productive du substrat, provoquant l'inhibition du substrat. En utilisant une série de mutants, nous avons étudié le rôle des résidus critiques dans la triade catalytique, le trou oxyanion et la poche de liaison de la choline, tels que Ser38, Tyr106, Asn147, Asp285, Trp287 et His288. Ces résultats ont révélé que Ser38 et His288 dans la triade catalytique sont essentiels pour l'activité ChoE tandis que Asp285 n'est pas essentiel. Conformément au mécanisme moléculaire déduit de ces structures, l'inhibition du substrat est abolie ou considérablement atténuée chez les mutants N147A, Y106A, D285N et W287A. Par-dessus tout, nous avons identifié trois conformations distinctes de Ser38 catalytique, dont la plasticité conformationnelle contrôle vraisemblablement la géométrie du site actif et donc les états fonctionnels de ChoE, ce qui est également corroboré par notre analyse structurale d'autres hydrolases SGNH. En résumé, ces travaux ont fourni des informations moléculaires sans précédent sur les acétylcholinestérases bactériennes et la famille des hydrolases SGNH.Acetylcholine (ACh), a well-known neurotransmitter in animals, is the substrate of both eukaryotic and prokaryotic acetylcholinesterases (AChE). The structure and the function of mammalian AChEs have been well studied due to their importance in both cholinergic brain synapses and the peripheral nervous systems. They are also a key drug target for many diseases such as Alzheimer's disease in humans. In contrast, prokaryotic acetylcholinesterases remain poorly understood despite a long history of studies. Pseudomonas aeruginosa bacterium possesses the choline acquisition system including the enzyme ChoE, helping it to import choline as a nutrient source. ChoE has been identified as a putative acetylcholinesterase which exhibits similar enzymatic properties to mammalian AChEs despite its much smaller size. In this work, to better understand the acetylcholinesterase of prokaryotic sources, we performed the structural and biochemical characterization of ChoE using X-ray crystallography and enzymology as the primary approaches. We have demonstrated that ChoE is indispensable for P. aeruginosa growth when acetylcholine is used as the sole carbon and nitrogen source. A comprehensive set of high-resolution structures of ChoE have been obtained including the complexes of enzyme with substrates, products, acyl intermediate and inhibitor. These structures have revealed the molecular determinants for substrate recognition, snapshots of the various catalytic steps, and the molecular basis of substrate inhibition at high substrate concentrations. From these results, the retarded release of the acetate product facilitates the nonproductive binding of substrate causing substrate inhibition. Using a series of mutants, we have studied the role of critical residues in the catalytic triad, the oxyanion hole and the choline-binding pocket, such as Ser38, Tyr106, Asn147, Asp285, Trp287 and His288. These results indicated that both Ser38 and His288 in the catalytic triad are strictly required for ChoE activity while Asp285 is not essential. Consistent with the molecular mechanism deduced from our structures, substrate inhibition is abolished or significantly alleviated in the N147A, Y106A, D285N and W287A mutants. Importantly, we have identified three distinct conformations of catalytic Ser38, whose conformational plasticity presumably controls the active site geometry and thus the functional states of ChoE, which is also substantiated by our structural analysis of other SGNH hydrolases. In summary, this work has provided unprecedented molecular insights into both bacterial acetylcholinesterases and the SGNH hydrolase family