Estratégias de rutura celular e extração de compostos bioativos de fotobiontes de líquenes

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em PlantasOs líquenes são uma relação simbiótica entre dois organismos, uma microalga (fotobionte) e um fungo (micobionte). As microalgas são organismos simples e com altas capacidades fotossintéticas e capazes de crescer em diferentes ambientes. Elas tornaram-se uma interessante fonte de compostos bioativos, contudo as microalgas isoladas de líquenes ainda não estão muito descritas e, em particular, pouco se sabe sobre o seu potencial de produção de compostos bioativos. No sentido de tirar o máximo partido das potencialidades das microalgas isoladas a partir de líquenes, é necessário garantir uma adequada rutura celular, de modo a permitir uma libertação eficiente dos compostos intracelulares. O objetivo deste trabalho é determinar quais os métodos de rutura celular com maior eficiência de rutura das células de microalgas isoladas de líquenes e quais garantem a integridade dos compostos orgânicos extraídos. Aplicaram-se diferentes métodos de rutura celular com diferentes condições a microalgas isoladas de líquenes de modo a determinar as melhores condições de operação para cada método de rutura. Os métodos aplicados foram ciclos de congelamento e descongelamento, sonicação, micro-ondas, homogeneização a altas velocidades e moinho de bolas. A eficiência da rutura celular e extração de compostos bioativos foi analisada por citometria de fluxo, espectroscopia e quantificação de alguns compostos primários (tais como hidratos de carbono e proteínas) produzidos e libertados pelas células após o tratamento. O método que apresentou maior eficiência de rutura e extração foi a sonicação durante 60 min com uma sonda de 40 kHz. Contudo, este método apresenta consumos energéticos e períodos de tratamento bastante elevados. Assim, surge o moinho de bolas como alternativa, em que foram usadas esferas com 0,5 mm de diâmetro a uma concentração de 32 % durante 6 min. Verificou-se tratar-se de um método simples, rápido e eficaz na extração e rutura celular, capaz de extrair os compostos presentes nas microalgas isoladas de líquenes e de manter a integridade de possíveis compostos de interesse. Este método apresentou ainda a vantagem de apresentar um consumo energético bastante reduzido.Lichens are organisms known by their symbiotic relationship between microalgae (photobiont) and fungi (mycobiont). Microalgae are a simple form of organisms with high photosynthetic efficiency and fast growth. They are a promising source of bioactive compounds, however microalgae isolated from lichens are still poorly understood, in particular their bioactive compounds production potential. In order to take advantage of this potential of microalgae isolated from lichens, an effective cellular disruption is required. A high disruption efficiency allows an improved release of the intracellular compounds. The main goal of this work is thus the assessment of which method can cause more efficient cellular disruption and maintain the integrity of the intracellular compounds released. Different cell disruption treatments were applied in order to determine the efficiency that they have on the recovery of intracellular compounds from microalgae isolated from lichens. Methods such freezing-thawing, ultrasonication, microwave, high-speed homogenization and bead milling were applied. All the applied methods were tested with different experimental conditions in order to define a better condition for each treatment. The efficiency of cellular disruption and extraction of intracellular compounds was analyzed by flow cytometry, spectroscopy at different wavelengths and quantifications of some primary metabolites produced by microalgae cells such as carbohydrates and proteins. The treatment with higher disruption efficiency (in terms of percentage of disrupted cells) and extraction was ultrasonication at 40 kHz for 60 min. Although this treatment was efficient, it presented higher energy consumptions and is time consuming. As an alternative, bead-milling with 0.5 mm beads at a concentration of 32 % for 6 min showed a similar efficiency in cellular disruption (but with a significantly lower time of operation, which is a significant advantage) and a still satisfactory performance in extracting compounds. It is a simple and efficient treatment capable of maintaining the integrity of the compounds, at a significantly lower level of energy consumption