Caracterización fenotípica y funcional de la sub-población de linfocitos B que expresan el receptor de IL-33 durante la gestación: Potencial implicancia en la protección del parto prematuro

Durante la preñez en los mamíferos, el sistema inmune materno enfrenta un doble dilema: debe ser capaz de, simultáneamente tolerar la presencia del feto semialogénico, generando mecanismos que eviten su rechazo, al tiempo que conserva capacidad de activación para enfrentar agentes infecciosos. Esto requiere el desarrollo de adaptaciones inmunológicas temporales y finamente reguladas que involucran tanto al sistema inmune innato como adaptativo. En este sentido se conoce que el compartimento de los linfocitos B (LB) experimenta profundas modificaciones durante la gestación, que involucran tanto cambios en su ontogenia como en la distribución de las principales poblaciones y funciones de estas. Con el fin de mejorar nuestra comprensión acerca de los mecanismos moleculares que regulan estas modificaciones transitorias descriptas en LB durante la gestación, se evaluó en profundidad, por medio de un gene-array, el perfil transcriptómico completo de LB aislados de bazo de ratones hembra preñados P (P) y no preñados (NP). El análisis in sílico demostró que 1136 genes presentan una expresión diferencial (ED) (625 regulados al alza y 511 regulados a la baja) en LB de ratones P respecto a ratones control NP. De modo de entender el significado biológico de la expresión diferencial de genes (EDGs) observada, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional, el cual mostró que la mayoría de los genes regulados a la baja pertenecían a vías de señalización que regulan la activación de los LB a través de su receptor (BCR); el procesamiento/presentación de antígenos y la activación independiente de LT a través de segundas señales (TLRs, BAFFR). Por otro lado, se observó también en los LB de ratones hembra P un patrón de expresión de genes (factores de transcripción) idénticos al descripto como potenciales marcadores de LB reguladores, una población de LB con fuerte capacidad inmunosupresora. Los resultados del análisis del gene-array sugirieron que los LB de ratones P adquieren una menor capacidad de activación que los LB de ratones NP, por lo cual a continuación evaluamos la producción de citoquinas pro y anti-inflamatorias por parte de LB provenientes de ambos grupos estimulados in vitro con lipopolisacárido (LPS). Observamos que LB de ratones P producen niveles significativamente menores de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), citoquina pro-inflamatoria, frente al desafío con LPS comparado a LB de ratones NP. Así mismo, se observó un aumento en la producción de la citoquina anti-inflamatoria interleuquina 10 (IL-10), el cual se ve reflejado únicamente en la población linfocitaria de la zona marginal del bazo (MZ). Estos resultados acompañan a los anteriores en la suposición de que, durante la preñez, los LB adquieren un perfil inmunosupresor, reaccionando de manera anti-inflamatoria ante un estímulo inflamatorio como lo es el LPS. Por otro lado, el análisis funcional, adicionalmente mostró un aumento en la expresión de ARNm de genes que corresponden a vías relacionadas con el ciclo celular y la replicación del ADN. Estudios de citometría de flujo en LB esplénicos confirmaron un aumento del marcador de proliferación ki-67, en la población celular de Linfocitos B1 (LB1) del bazo de ratones P respecto de ratones NP. Así mismo, se observó una mayor proporción de LB1 esplénicos acompañados de una menor producción de TNf-α y mayor producción de IL-10 por parte de estos, en ratones P. Al mismo tiempo, esta población presentó una menor expresión en su superficie del marcador CD1d en ratones P, el cual se relaciona con una mayor producción de anticuerpos naturales por parte de LB, respecto de ratones NP. La producción de anticuerpos sin aparente estímulo antigénico ha sido un tema de constante estudio en el contexto del embarazo. Previamente se ha demostrado que existe un aumento de la producción de anticuerpos naturales por parte de LB durante la preñez, así como de anticuerpos asimétricos, cuya función es el bloqueo de aloantígenos fetales. En este sentido, se ha relacionado fuertemente la acción del factor bloqueante inducido por progesterona (PIBF) en la producción de estos anticuerpos, esenciales para la preñez y cuyos niveles se ven afectados en gestaciones que no llegan a término. Más aún, se ha demostrado recientemente, en un modelo murino de parto prematuro (PP), que la mucosa uterina libera interleuquina IL-33 (IL-33) ante un estímulo inflamatorio la cual induce la producción de PIBF por parte de LB presentes en la interface materno fetal, restaurando de este modo la homeostasis inmunológica y evitando el desencadenamiento del PP. La interleuquina-33 (IL-33) es una alamina asociada a las mucosas, que pertenece a la familia de citoquinas IL-1. En situaciones de estrés, la misma desempeña un rol clave tanto en la inmunidad innata como adaptativa, contribuyendo a mantener la homeostasis de los tejidos. Además, se conoce que funciona como un regulador positivo que inicia y mantiene una respuesta inmune de tipo Th2. La lL-33 actúa a través de su receptor (ST2) el cual, dentro del compartimento de LB, se expresa preponderantemente en la sub-población de LB1. De manera interesante, nuestro análisis del gene-array mostró un aumento significativo en los niveles de ARNm del receptor de IL-33 (Il1rl1) en LB de ratones P comparado a NP, los cuales fueron confirmados a nivel proteico (ST2). Un análisis más profundo mostró que la expresión de ST2 se encuentra significativamente aumentada en LB1 esplénicos y de la cavidad peritoneal de ratones P respecto de ratones NP. Adicionalmente, observamos que los LB1 provenientes de ambos tejidos, exhiben una cinética particular de expresión de este receptor, durante distintas etapas de la gestación. Se observó un marcado aumento de la expresión de ST2 en LB1 esplénicos, en los días 12 y 14 de la gestación, y luego disminuye hacia el final de la gestación a los niveles observados en animales no gestantes. No se observó una relación directa en la modulación de la expresión de ST2 en LB respecto a factores hormonales (estrógeno y progesterona), aunque sí se ve afectada su expresión en LB por la presencia de aloantígenos paternos. Finalmente, utilizando un modelo murino de PP inducido por LPS puesto a punto durante mi trabajo de tesis doctoral, observamos que los niveles de LB1 esplénicos que expresan ST2 aumentan significativamente durante la fase aguda del PP, comparado con ratones hembra con gestaciones normales. Se demostró, además, que los LB1-ST2+ esplénicos presentan una respuesta anti-inflamatoria en respuesta al LPS, demostrada por una mayor producción de IL-10 y menor producción de TNF-α analizados por citometría de flujo. De manera interesante, se observó también un aumento significativo del número de LB deciduales que expresan ST2+ durante la fase aguda de inducción del PP. En resumen, nuestros resultados sugieren que los LB de ratones P adquieren un perfil tolerogénico e hiporreactivo. Es razonable pensar que estos cambios son inducidos en el compartimento de LB de modo de facilitar la tolerancia de los aloantígenos presentes en el feto. Sin embargo, nos permiten también entender mejor y explicar desde un punto de vista inmunológico la mayor susceptibilidad a ciertas infecciones características de las mujeres gestantes. Adicionalmente, buscamos enfatizar el rol fundamental de los LB1-ST2+ en la protección de la gestación. La caracterización de esta población en un modelo de preñez, así como en el PP, refuerzan su especial importancia como componentes necesarios para una preñez exitosa.Facultad de Ciencias Exacta