Application of biophysical methods to assess the role of platelet cytoskeletal proteins in platelet biomechanics

The biomechanical (Young's modulus, adhesion force, deformability) properties of platelets depend on the cytoskeleton and have an undisputed influence on physiological and pathological processes such as hemostasis and thrombosis. The alterations of these biomechanical properties can be used as label-free diagnostic markers in initiation or progressive diseases such as MYH9-inherited disease. Therefore, the focus of my thesis was to investigate the relationship between the changes in platelet cytoskeleton proteins and the resulting biomechanical properties using biophysical methods. In the first chapter of my thesis I focused on my review of the biophysical methods that are most commonly used to assess and quantify the biomechanical properties of platelets. In this review, I provide an in-depth insight into the governing principles and instrumentation setup and discuss relevant examples applied to platelet mechanics. In addition, my review also summarizes the limitations of these biophysical methods and highlight latest improvements. The review covers the following techniques: micropipette aspiration, atomic force microscopy (AFM), scanning ion conductance microscopy (SICM), tensile force microscopy on hydrogel substrates, microcolumns, and deformable 3D substrates, and real-time deformability cytometry (RT-DC). This review is directed toward clinician scientists who are interested in exploring applications of single-cell based biophysical approaches in unraveling the role of platelet biomechanics in hemostasis and thrombosis research. In the second chapter of my thesis, I present my research paper on the influence of commonly used ex vivo anticoagulants on the intrinsic biomechanical properties and functional parameters (e.g. activation profils) of human platelets. To comprehensively assess this, platelets obtained in different ex vivo anticoagulants such as ACD-A, Na-Citrate, K2-EDTA, Li-Heparin, and r-Hirudin were used, and their biomechanical properties were determined by real-time fluorescence and deformability cytometry (RT-FDC). Flow cytometry, and confocal laser scanning fluorescence microscopy were used to determine platelet function properties. K2-EDTA and Li-Heparin were found to affect platelet biomechanics by increasing actin polymerization of non-stimulated human platelets. This increased actin polymerization results in decreased platelet deformation. It is recommended that an ex vivo anticoagulant such as ACD-A, Na-Citrate, or r-Hirudin be chosen for the study of the cytoskeleton of human platelets and, if possible, that it not be exchanged, because comparability of results is not assured. Furthermore, I demonstrate the significance of choosing correct ex vivo anticoagulants in RT-FDC by showing that platelets from a healthy donor and a MYH9 patient with the E1841K point mutation differ in their deformation. This paper is the first comprehensive investigation at the single platelet level to establish the relevance of preanalytical standardization in platelet sample preparation for biomechanical studies. The third chapter of my thesis is focused on the biomechanical analyses of platelets and thrombi from MYH9-related disease. Here I studied three Myh9 mouse lines with a point mutation in the Myh9 gene at positions 702, 1424, or 1841. Furthermore, two MYH9 patients (MYH9 p.D1424N, MYH9 p.E1841K) were examined. MYH9-related disease (MYH9-RD) presents with macrothrombocytopenia with a moderate bleeding tendency. It is caused by mutations in the MYH9 gene that lead to alteration of non-muscle myosin heavy chains type IIA (NMMHC IIA), resulting in disruption of the platelet cytoskeleton. Western blot analysis, flow cytometry, in vitro aggregometry, and transmission electron microscopy demonstrated that Myh9 point mutant mice have comparable primary function compared to the control group. The heterozygous point mutations in the Myh9 gene resulted in decreased platelet deformation (RT-FDC), decreased platelet adhesion to collagen (single platelet force spectroscopy-SPFS), and decreased platelet-platelet interaction forces (SPFS). Decreased platelet force (Micropost Arrays) results in softer thrombi (colloidal probe Spectroscopy), impaired clot retraction, and thus prolonged bleeding time. The R702C, D1424N, and E1841K mutations have a similar effect on platelet biomechanical functions, although the E1841K mutation had less impact on thrombus formation and stiffness. MYH9-RD patients have an increased risk of bleeding, and the antifibrinolytic drug tranexamic acid (TXA) is one way to control bleeding complications in these patients. It was shown that TXA treatment significantly reduced bleeding time in the three Myh9 mouse models, confirming that the enhanced bleeding phenotype due to decreased platelet forces in Myh9 mutant mice can be compensated by the addition of TXA. With the biophysical methods and research results presented in my thesis, it is clear that it is essential to study the altered response of the platelet cytoskeleton by cytoskeletal mutations, biochemical, physical stimuli, or by pharmacological aspects. This will provide us with an opportunity to better understand the underlying mechanisms and thus contribute to better clinical treatment.Die biomechanischen (Elastizitätsmodul, Adhäsionskraft, Verformbarkeit) Eigenschaften von Thrombozyten hängen vom Zytoskelett ab und haben einen unbestrittenen Einfluss auf physiologische und pathologische Prozesse wie Hämostase und Thrombose. Die Veränderungen dieser biomechanischen Eigenschaften können als markierungsfreie diagnostische Marker bei beginnenden oder fortschreitenden Erkrankungen wie der MYH9-vererbten Erkrankung verwendet werden. Daher war der Fokus meiner Doktorarbeit, die Beziehung zwischen den Veränderungen in den Proteinen des Thrombozyten-Zytoskeletts und den daraus resultierenden biomechanischen Eigenschaften mit biophysikalischen Methoden zu untersuchen. Im ersten Kapitel meiner Doktorarbeit habe ich mich auf die biophysikalischen Methoden konzentriert, die am häufigsten zur Bewertung und Quantifizierung der biomechanischen Eigenschaften von Thrombozyten verwendet werden. In meinem Übersichtsartikel gebe ich einen detaillierten Einblick in die zugrunde liegenden Prinzipien, den Aufbau der Instrumente und diskutiere relevante Beispiele. Darüber hinaus fasse ich die Grenzen dieser biophysikalischen Methoden zusammen und weise auf aktuelle Verbesserungen hin. Die Übersicht umfasst die folgenden Techniken: Mikropipettenaspiration, Rasterkraftmikroskopie (AFM), Raster-Ionenleitfähigkeitsmikroskopie (SICM), Zugkraftmikroskopie auf Hydrogelsubstraten, Mikrosäulen und verformbare 3D-Substrate sowie Echtzeit-Verformbarkeitszytometrie (RT-DC). Dieser Übersichtsartikel richtet sich an klinisch-wissenschaftliche Forscher, die daran interessiert sind, die Rolle der Thrombozytenbiomechanik in der Hämostase- und Thromboseforschung mit Hilfe dieser einzellbasierten biophysikalischen Methoden zu erforschen. Im zweiten Kapitel meiner Doktorarbeit stelle ich meine Forschungsarbeit über den Einfluss von üblicherweise verwendeten Ex-vivo-Antikoagulanzien auf die intrinsischen biomechanischen Eigenschaften und funktionellen Parametern (z.B. Aktivierungsprofile) menschlicher Thrombozyten vor. Um dies umfassend zu beurteilen, wurden Thrombozyten verwendet, die in verschiedenen Ex-vivo-Antikoagulanzien wie ACD-A, Na-Citrat, K2-EDTA, Li-Heparin und r-Hirudin gewonnen wurden und ihre biomechanischen Eigenschaften wurden durch Echtzeit-Fluoreszenz- und Verformbarkeitszytometrie (RT-FDC) bestimmt. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie und konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie wurden die Eigenschaften der Thrombozytenfunktion ermittelt. Es wurde festgestellt, dass K2-EDTA und Li-Heparin die biomechanischen Eigenschaften von Thrombozyten beeinflussen, indem die Aktinpolymerisation von nicht stimulierten menschlichen Thrombozyten erhöht wird. Diese erhöhte Aktinpolymerisation führt zu einer geringeren Verformung der Thrombozyten. Es wird empfohlen, für die Untersuchung des Zytoskeletts menschlicher Thrombozyten ein Ex-vivo-Antikoagulans wie ACD-A, Na-Citrat oder r-Hirudin zu wählen und es nach Möglichkeit nicht auszutauschen, da die Vergleichbarkeit der Ergebnisse nicht gewährleistet ist. Darüber hinaus demonstriere ich die Bedeutung der Wahl der richtigen Ex-vivo-Antikoagulanzien mit Hilfe der RT-FDC, indem ich zeige, dass Thrombozyten von einem gesunden Spender und einem MYH9-Patienten mit der Punktmutation E1841K sich in ihrer Verformung unterscheiden. Diese Forschungsarbeit ist die erste umfassende Untersuchung auf der Ebene einzelner Thrombozyten, die die Bedeutung der präanalytischen Standardisierung bei der Vorbereitung von Thrombozytenproben für biomechanische Studien belegt. Das dritte Kapitel meiner Doktorarbeit befasst sich mit den biomechanischen Analysen von Thrombozyten und Thromben von der MYH9-vererbten Erkrankung. Dafür wurden drei Myh9-Mauslinien mit einer Punktmutation im Myh9-Gen an den Positionen 702, 1424 oder 1841 sowie zwei MYH9-Patienten (MYH9 p.D1424N, MYH9 p.E1841K) untersucht. Die MYH9-vererbte Erkrankung äußert sich in einer Makrothrombozytopenie mit mäßiger Blutungsneigung. Sie wird durch Mutationen im MYH9-Gen verursacht, die zu einer Veränderung der schweren Ketten des nicht muskulären Myosins Typ IIA (NMMHC IIA) und damit zu einer Störung im Zytoskelett der Thrombozyten führen. Durch Western-Blot Analyse, Durchflusszytometrie, in-vitro Aggregometrie und Transmissionselektronenmikroskopie wurde gezeigt, dass Myh9-Punktmutanten-Mäuse im Vergleich zur Kontrollgruppe eine vergleichbare Primärfunktion haben. Die heterozygoten Punktmutationen im Myh9-Gen führten zu einer geringeren Verformung der Thrombozyten (RT-FDC), zu einer verminderten Thrombozytenadhäsion auf Kollagen (Kraft-Spektroskopie einzelner Thrombozyten - SPFS) und verminderten Thrombozyten-Thrombozyten-Interaktionskräften (SPFS). Die verminderte Thrombozytenkraft (Micropost Arrays) führt zu weicheren Thromben (kolloidale Probenspektroskopie), zu einer beeinträchtigten Retraktion des Blutgerinnsels und somit zu einer verlängerten Blutungszeit. Die Mutationen R702C, D1424N und E1841K haben eine ähnliche Wirkung auf die biomechanischen Funktionen der Thrombozyten, wobei die Mutation E1841K eine geringere Auswirkung auf die Thrombusbildung und -steifigkeit hatte. MYH9-Patienten haben ein erhöhtes Blutungsrisiko und das Antifibrinolytikum Tranexamsäure (TXA) ist eine Möglichkeit, Blutungskomplikationen bei diesen Patienten zu kontrollieren. Es wurde gezeigt, dass die TXA Behandlung die Blutungszeit in den drei Myh9-Mausmodellen signifikant reduziert und somit bestätigt, dass der verstärkte Blutungsphänotyp aufgrund der verminderten Thrombozytenkräfte in Myh9-Mutantenmäusen durch die Zugabe von TXA kompensiert werden kann. Mit den in meiner Doktorarbeit vorgestellten biophysikalischen Methoden und Forschungsergebnissen wird deutlich, dass es essentiell wichtig ist, die veränderte Reaktion des Zytoskeletts der Thrombozyten durch Zytoskelettmutationen, biochemische, physikalische Stimuli oder durch pharmakologische Aspekte zu untersuchen. Damit wird uns eine Möglichkeit gegeben, die zugrunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen und somit zu einer besseren klinischen Behandlung beizutragen