CRISPR/Cas9-mediated generation and characterization of glucocorticoid-resistant virus-specific T cells

Patients after organ transplantation or hematopoietic stem cell transplantation suffer from impaired T-cell function and are at high risk for viral infections, such as cytomegalovirus (CMV) infections. Adoptive T-cell transfer is a way to restore T-cell immunity, by infusing enriched virus-specific donor T cells into the patient. Over the past years it has been shown that this approach can be applied successfully. However, many of these patients need to receive high-dose glucocorticoid therapy, impairing proliferation capacity of adoptively transferred virus-specific T cells by binding to their glucocorticoid receptor (GR). The most definite way of preventing the adverse effects of glucocorticoids is the genetic knockout of the endogenous GR in virus-specific T cells. To this end, CMV-specific T cells were enriched via cytokine capture technique, an IFN-γ-based enrichment method, and the GR was knocked out via CRISPR/Cas9. Successful enrichment of CMV-specific T cells, as well as high knock-out rates of the GR in enriched cells were demonstrated. The T-cell product showed a high purity, a stable phenotype eligible for adoptive T-cell therapy and a high cell viability. Further, not only glucocorticoid resistance, but also sensitivity for cyclosporin A were confirmed, providing a rescue treatment concerning safety issues in vivo. Glucocorticoid-resistant CMV-specific T cells were functional in terms of IFN-γ secretion upon specific restimulation, proliferation and specific target cell killing in vitro. The developed automatable engineering strategy will allow straightforward upgrading to a good manufacturing practice-conform generation of the cell product. This innovative protocol lays the foundation for a widely applicable T-cell product to treat refractory viral infections in patients needing glucocorticoid therapy.Bis zur Rekonstitution der T-Zell Immunität birgt eine Organtransplantation oder Stammzelltransplantation das Risiko für virale Infektionen, darunter oftmals Infektionen mit dem Zytomegalie-Virus (CMV). Ein adoptiver T-Zell Transfer ermöglicht, die T-Zell Immunität des Patienten mit Hilfe von virus-spezifischen Spender-Zellen wiederherzustellen. Dieser Therapieansatz wird seit Jahren erfolgreich angewandt. Viele dieser Patienten benötigen jedoch Glukokortikoide in hoher Dosierung, die durch Bindung an den Glukokortikoid-Rezeptor (GR) ebenso die im Rahmen eines adoptiven T-Zelltransfers infundierten, virus-spezifischen T-Zellen in ihrer Proliferation hemmen. Als eindeutigster Lösungsansatz zur Verhinderung dieser unerwünschten Wirkung ergibt sich der genetische Knock-out des GR in virus-spezifischen T-Zellen. Mittels „Cytokine Capture“ Technik, einer IFN-γ basierten Anreicherungsmethode, und dem „CRISPR/Cas9“-System wurden glukokortikoid-resistente CMV-spezifische T-Zellen hergestellt. CMV-spezifische T-Zellen wurden erfolgreich angereichert und der Knock-out des GR war in den angereicherten Zellen mit hoher Effizienz möglich. Das entwickelte T-Zellprodukt zeichnete sich durch eine hohe Reinheit an T-Zellen, einen stabilen, für den adoptiven T-Zell Transfer geeigneten Phänotyp und eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen aus. Nicht nur die Glukokortikoid-Resistenz, sondern auch ein Ansprechen auf Cyclosporin A, das im klinischen Notfall einen Sicherheitsmechanismus zur Hemmung der Zellen darstellt, wurden experimentell bestätigt. Glukokortikoid-resistente CMV-spezifische T-Zellen waren funktionell hinsichtlich ihrer IFN-γ Sekretion nach Restimulation, ihrer Proliferation und ihrer spezifischen zytotoxischen Aktivität gegen Zielzellen in vitro. Der entwickelte automatisierbare Ansatz zur Herstellung eines gentechnisch veränderten T-Zellprodukts ermöglicht eine schnelle Umsetzung in die gute Herstellungspraxis-konforme Produktion. Dieses innovative Protokoll legt den Grundstein für ein breit anwendbares T-Zell Produkt für die Behandlung von Patienten mit refraktären viralen Infektionen und notwendiger Glukokortikoid-Therapie