Contribution to the study of Dihydropyrimidine Dehydrogenase (DHPD) of the Catalytic Pathway of Pyrimidines in Oryza sativa L.

El arroz es un alimento esencial dentro de la canasta familiar lo que lo hace uno de los cereales más consumidos, pese a esto, en los últimos años se han evidenciado cambios climáticos severos como altas temperaturas y continuas precipitaciones que afectan el crecimiento, reproducción y ciclos vitales de las plantas dado por la disminución en la captación de nutrientes a través del suelo (Peñuelas, 2004), lo cual conlleva a que estos factores abióticos representen una gran problemática, ya sea en la estructura de la planta o en las diferentes rutas metabólicas ocasionando una expresión muy alta o muy baja de ciertos genes regulados implicados en la tolerancia frente al estrés abiótico como mecanismo de defensa en la planta de arroz (Soren, 2010). Una de las rutas presentes en la tolerancia frente a factores abióticos como sequía y salinidad podría ser la ruta de pirimidinas, ya que, se ha reportado una sobre expresión frente a este tipo de estrés en la primera enzima de degradación de pirimidinas la Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DHPD) (Liu et al. 2009). La proteína se ha estudiado en hígado de cerdo demostrando que está conformada por 5 dominios siendo uno de ellos una subunidad donde FMN y NADPH se acoplan (Dobritzsch, et al. 2002), y que en plantas se desconoce, por lo que la DHPD tiene reportada tan solo la mitad del tamaño en comparación a la DHPD de mamíferos, faltando la subunidad en la que se ensambla NADPH y se da el transporte de electrones desde este al sustrato (Zrenner et al., 2006). Esto sugiere que en plantas se requiere de una interacción entre DHPD y la proteína que se encargue de la transferencia de electrones para un óptimo funcionamiento en la vía de degradación de Uracilo o Timina; sin embargo, esto no ha sido reportado para ninguna especie vegetal. Un posible candidato del fragmento carente es la β-subunidad de Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato-Glutamato Sintasa (NADPH-GltS) por su homología reportada en bancos de secuencias con el segmento faltante de DHPD (Vanoni et al. 1999). A partir de esto, el trabajo realizado tuvo como fin obtener los genes que posiblemente hacen parte de la subunidad complementaria al dominio de la proteína DHPD de la ruta de degradación de pirimidinas en Oryza sativa L. y así contribuir a futuros estudios con esta enzima y su importancia en la tolerancia frente al estrés abiótico ocasionado por salinidad y altas sequias que trae consigo los problemas climáticos que actualmente se presentan. Para esto, se clonaron las dos isoformas de la β-subunidad de NADH-GltS en el vector de expresión pET19b para futuros ensayos de complementación entre las Isoformas de la β-subunidad de NADH-GltS y la DHPD. La clonación se realizó mediante la extracción de ARN en plantas de arroz y posteriormente de obtuvo ANDc, desde este se diseñaron primers que funcionen como templado para la amplificación de las secuencias de las dos isoformas de la β-subunidad de NADH-GltS. La β-subunidad de NADH-GltS 1 se clonó en vector de expresión pET-19b utilizando tanto para la secuencia de NADH-GltS 1 como para el vector la enzima de restricción XhoI. Los fragmentos fueron purificados con QIAquick Gel Extraction Kit de QIGEN, para posterior ligación y transformación en células quimicompetentes DH5α. En el caso de la β-subunidad de NADH-GltS 2 se realizó el mismo procedimiento pero cambiando las enzimas de restricción, empleando XhoI y BamHI para la secuencia y el vector pET-19b. Finalmente se obtuvo la clonación de la β-subunidad de NADH-GltS 1 corroborándose mediante PCR, restricción enzimática y secuenciación de los clones. Sin embargo, la clonación de la β-subunidad de NADH-GltS 2 no se consiguió debido a la similitud entre las isoformas planteando posibles estrategias a partir de los primers para próximos estudios. Por último, se dejaron creciendo las bacterias transformadas de la isoforma 1 en medio LB para realizar congelados de las mismas con la finalidad de preservar las secuencias de interés. Como conclusión de esta investigación se obtuvieron células transformadas con la β-subunidad de NADH-GltS 1, estas contribuirán a estudios de interacción entre el posible dominio transferente de electrones y la enzima DHPD correspondiente a la primera ruta de degradación de pirimidinas en Oryza sativa L, proporcionando herramientas para investigaciones de la ruta y la expresión de la enzima al ser sometida a factores de estrés abiótico como sequía y salinidad. Como conclusión de esta investigación se obtuvieron células transformadas con la β-subunidad de NADH-GltS 1, estas contribuirán a estudios de interacción entre el posible dominio transferente de electrones y la enzima DHPD correspondiente a la primera ruta de degradación de pirimidinas en Oryza sativa L, proporcionando herramientas para investigaciones de la ruta y la expresión de la enzima al ser sometida a factores de estrés abiótico como sequía y salinidad.Rice is an essential food in the family basket, which makes it one of the most consumed cereals, despite the fact that in recent years there have been severe climatic changes such as high temperatures and continuous rainfall that affect growth, reproduction and cycles (Peñuelas, 2004), which leads to the fact that these abiotic factors represent a major problem, either in the structure of the plant or in the different metabolic pathways Resulting in very high or very low expression of certain regulated genes involved in tolerance to abiotic stress as a defense mechanism in the rice plant (Soren, 2010). One of the routes present in tolerance to abiotic factors such as drought and salinity could be the pathway of pyrimidines, since an overexpression against this type of stress has been reported in the first pyrimidine degradation enzyme Dihydropyrimidine Dehydrogenase ( DHPD) (Liu et al., 2009). The protein has been studied in pig liver showing that it is made up of 5 domains, one of them being a subunit where FMN and NADPH are coupled (Dobritzsch, et al., 2002), and in plants is unknown, so DHPD has Reported only half the size compared to mammalian DHPD, lacking the subunit in which NADPH is assembled and the electron transport from the latter to the substrate occurs (Zrenner et al., 2006). This suggests that in plants an interaction between DHPD and the protein that is in charge of the transfer of electrons is required for an optimal operation in the degradation pathway of Uracil or Thymine; However, this has not been reported for any plant species. A possible candidate of the missing fragment is the β-subunit of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate-Glutamate Synthase (NADPH-GltS) for its homology reported in sequence banks with the missing DHPD segment (Vanoni et al. From this, the work was done to obtain the genes that are possibly part of the subunit complementary to the DHPD protein domain of the pyrimidine degradation pathway in Oryza sativa L. and thus contribute to future studies with this enzyme and Its importance in tolerance to the abiotic stress caused by salinity and high droughts that brings with it the current climatic problems. For this, the two NADH-GltS β-subunit isoforms were cloned into the pET19b expression vector for future complementation assays between the NADH-GltS β-subunit isoforms and the DHPD. Cloning was performed by extracting RNA in rice plants and subsequently obtained ANDc, from which primers were designed to function as annealing for the amplification of the two isoforms of the NADH-GltS β-subunit isoforms. The β-subunit of NADH-GltS 1 was cloned into pET-19b expression vector using both the NADH-GltS 1 and the restriction enzyme vector XhoI. The fragments were purified with QIAquick Gel Extraction Kit from QIGEN, for subsequent ligation and transformation into DH5α chemically-responsive cells. In the case of the β-subunit of NADH-GltS 2 the same procedure was performed but changing the restriction enzymes, using XhoI and BamHI for the sequence and vector pET-19b. Finally, cloning of the NADH-GltS 1 β-subunit was obtained by PCR, enzymatic restriction and sequencing of the clones. However, cloning of the β-subunit of NADH-GltS 2 was not achieved due to the similarity between the isoforms posing possible strategies from the primers for upcoming studies. Finally, the transformed bacteria of the isoform 1 were allowed to grow in LB medium to carry out frozen of the same in order to preserve the sequences of interest. As a conclusion of this investigation, cells transformed with the β-subunit of NADH-GltS 1 were obtained, which will contribute to studies of interaction between the possible electron transfer domain and the DHPD enzyme corresponding to the first degradation pathway of pyrimidines in Oryza sativa L , Providing tools for investigating the route and expression of the enzyme when subjected to abiotic stress factors such as drought and salinity. As a conclusion of this investigation, cells transformed with the β-subunit of NADH-GltS 1 were obtained, which will contribute to studies of interaction between the possible electron transfer domain and the DHPD enzyme corresponding to the first degradation pathway of pyrimidines in Oryza sativa L , Providing tools for investigating the route and expression of the enzyme when subjected to abiotic stress factors such as drought and salinity.Universidad de los Ande