Histological analysis of in vitro morphogenesis of Taraxacum belorussium Val. N. Tikhom.

Taraxacum belorussicum Val. N. Tikhom jest gatunkiem endemicznym i obligatoryjnym apomiktem. Wykorzystywany jest w analizach genetycznych, embriologicznych oraz w technice kultur in vitro. Celem niniejszej pracy była analiza histologiczna zainicjowanej w warunkach kultury in vitro morfogenezy z niedojrzałych zarodków partenogenetycznych T. belorussicum. W pracy analizowano morfogenezę regulowaną zarówno w warunkach zróżnicowanego poziomu etylenu oraz przy zastosowaniu dwóch rodzajów cytokinin benzyloadeniny oraz N-6-furfuryladeniny (BAP i KIN) w warunkach obecności auksyny kwasu indolilo-3-octowego (IAA). Materiał do badań stanowiły cięte eksplantaty niedojrzałych zarodków partenogenetycznych w 55 dniu kultury in vitro z sześciu układów doświadczalnych (½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP+10µM ACC; ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP+100µM ACC, ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP+5µM AgNO3 , ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP+10µM AgNO3 , ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP + 5µM AVG, ½ MS + 113µM IAA + 0,5µM KIN), kontrolę stanowiła pożywka ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP. Pobrane w warunkach sterylnych fragmenty eksplantatów utrwalono w 5% glutaraldehydzie w 0,1M buforze fosforanowym. Utrwalony materiał został zatopiony według procedury z wykorzystaniem żywicy syntetycznej (Technovit 7100). Wybarwione preparaty analizowano za pomocą mikroskopu świetlnego (Nikon Eclipse E400) oraz mikroskopu fluorescyjnego przy użyciu filtra wzbudzenia N UV – 2A (EX330-380, DM400, BA420). Na podstawie analizy wykazano, że rodzaj cytokininy oraz zastosowanie prekursora syntezy etylenu (ACC - kwas 1-aminocyklopropano-1-karboksylowy) oraz inhibitorów jego funkcji regulatorowej (AgNO3 - azotan srebra) i syntezy (AVG - aminoetoksyglicyna) mają istotny wpływ na morfogenezę T. belorussicum. Wykazano, że indukowana w układach badawczych morfogeneza miała charakter bezpośredniej i asynchronicznej organogenezy, wśród której wyróżniano kaulogenezę oraz ryzogenezę. We wszystkich układach doświadczalnych podobnie jak i w kontroli układ tkanek eksplantatu uległ licznym aberracjom, co nie przekładało się na obniżenie potencjału morfogenetycznego niedojrzałych zarodków partogenetycznych. Eksplantaty wszystkich układów wykazywały także zróżnicowanie cytologiczne. Ryzogeneza obserwowana była jedynie w układach o zahamowanej syntezie etylenu (AVG) oraz w układzie kontrolnym, co oznacza, że nadmierna koncentracja etylenu działa hamująco na indukcję korzeni T. belorussicum. Zwiększona ilość etylenu wpływa jednakże na przyśpieszenie rozwoju pędów przybyszowych i zwiększenie ich liczebności, a obniżenie poziomu etylenu oraz zahamowanie jego funkcji regulatorowej wpłynęło pozytywnie na indukcję białek w analizowanym materiale. Słabe symptomy somatycznej embriogenezy identyfikowano sporadycznie i tylko w układzie o ograniczonej funkcji regulatorowej etylenu (5 µM AgNO3). Kaloza, marker stresu roślinnego oraz somatycznej embriogenezy obserwowana była jedynie w komórkach tkanki przewodzącej, co dodatkowo potwierdza brak potencjału embriogennego wybranego materiału roślinnego w zastosowanych warunkach. Powszechna w analizowanych próbkach extracellular matrix (ECM), z wyłączeniem układu ze wzmożoną zawartością etylenu (100µM ACC), lokalizowała się w przestrzeniach międzykomórkowych zarówno eksplantatów jak i regenerantów i oprócz kontroli, w której wykazano jej białkowo-pektynowy skład, ECM miała wyłącznie pektynowy charakter. W związku, że zaobserwowano niewielkie symptomy embrionegezy somatycznej, a raczej jedynie struktury podobne do zarodków somatycznych w układzie z zmniejszoną ilością AgNO3 (5µM) uważa się, że obecność ECM w układach miała charakter sygnalizujący lub obronny. Obecność prekursora etylenu (ACC) wpłynęło na przyspieszenie rozwoju regenerantów oraz zwiększenie ich liczebności. Za pomocą analizy potwierdzono, że etylen ma istotny wpływ na indukcję morfogenezy Taraxacum belorussicum.Taraxacum belorussicumVal. N. Tikhom is an endemic species and an obligatory apomict. It is used in genetic and embryological analyzes and in in vitro techniceculture. The aim of this study was the histological analysis of the morphogenesis from immature parthenogenetic embryos of T.belorussicum initiated in in vitro culture conditions. The study analyzed the morphogenesis regulated both under the conditions of various levels of ethylene and with the use of two types of cytokinins benzyladenine and N-6-furfuryladenine (BAP and KIN) in the presence of indolyl-3-acetic acid (IAA) auxin.The research material consisted of cut explants of immature parthenogenetic embryos on the 55th day of in vitro culture from six systems (½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP+10µM ACC; ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP+100µM ACC, ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP+5µM AgNO3 , ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP+10µM AgNO3 , ½ MS + 5.7µM IAA + 4.44µM BAP + 5µM AVG, ½ MS + 113µM IAA + 0,5µM KIN). The fragments of explants collected under sterile conditions were fixed in 5% glutaraldehyde in 0.1M phosphate buffer. The fixed material was embedded according to the synthetic resin procedure (Technovit7100). The stained slides were analyzed with a light microscope (Nikon Eclipse E400) and a fluorescent microscope with an N UV-2A excitation filter (EX330-380, DM400, BA420). The analysis showed that the type of cytokinin and the use of the precursor of ethylene synthesis (ACC - 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) and inhibitors of its regulatory function (AgNO3 - silver nitrate) and synthesis (AVG - aminoethoxyglycine) have a significant effect on the morphogenesis of T. belorussicum. It has been shown that the morphogenesis induced in the research systems was of direct and asynchronous organogenesis, among which cokulogenesis and risogenesis were distinguished. In all experimental systems, as well as in the control, the system of the tissues of the graft was subject to numerous aberrations, which did not translate into a reduction in the morphogenetic potential of the immature partogenetic embryos. The explants of all systems also showed cytological differentiation. Rhizogenesis was observed only in the systems with inhibited synthesis of ethylene (AVG) and in the control system, which means that the excessive concentration of ethylene inhibits the induction of T. belorussicum roots. However, the increased amount of ethylene accelerates the development of adventitious shoots and increases their number, and the reduction of ethylene levels and inhibition of its regulatory function positively influenced the protein induction in the analyzed material. Weak symptoms of somatic embryogenesis were identified sporadically and only in a system with a limited regulatory function of ethylene (5 µM AgNO3 ). Callose, a marker of plant stress and somatic embryogenesis, was observed only in the cells of the conducting tissue, which additionally confirms the lack of the embryogenic potential of the selected plant material under the applied conditions. Common in the analyzed samples of extracellular matrix (ECM), excluding the system with increased ethylene content (100μM ACC), it was located in the intercellular spaces of both explants and regenerants, and apart from the control, which showed its protein-pectin composition, the ECM was only pectin in nature . Due to the fact that slight symptoms of somatic embryo were observed, or rather only somatic embryo-like structures in the system with a reduced amount of AgNO3 (5 µM), it is believed that the presence of ECM in the systems was either signaling or protective. The presence of ethylene precursor (ACC) accelerated the development of regenerants and increased their number. The analysis confirmed that ethylene has a significant effect on the induction of Taraxacum belorussicum morphogenesis