Déterminants de la formation de biofilm chez les symbiotes anaérobes strictes Bacteroides thetaiotaomicron et Veillonella parvula

The human gut microbiota constitutes a dense multi-species anaerobic biofilm-like structure in which adhesion has been proposed to play a key role for bacterial colonization, maintenance and function. However, classical models of biofilm formation are either minor members of the gut microbiota community, often studied in presence of oxygen, or pathogenic gut bacteria. During my thesis, I have used genetic screens to identify determinants of in vitro biofilm formation in two relevant strict anaerobe gut symbionts, Bacteroides thetaiotaomicron and Veillonella parvula. B. thetaiotaomicron is one of the most abundant Gram-negative symbionts of the human gut microbiota. Although several clinical B. thetaiotaomicron isolates were shown to produce biofilms, the genetically amenable reference strain VPI 5482 is a poor biofilm former in vitro. I showed that deletion of capsule 4, one of the 8 capsular polysaccharides (CPS) of B. thetaiotaomicron, leads to the genesis of a subpopulation of acapsulated cells that have increased biofilm capacity. Whereas expression of most B. thetaiotaomicron capsules masked biofilm formation, the expression of capsule 8 induced biofilm formation, suggesting it might directly promote adhesion. Taken together, these results show that CPS expression is a major determinant of B. thetaiotaomicron biofilm formation. I also showed that addition of either bile extract or taurolithocholate induced biofilm formation in most B. thetaiotaomicron isolates. Bile-induced biofilm formation involved a putative secreted DNAse. Consistently, addition of a commercial DNAse to the culture medium complemented the lack of bile-induced biofilm formation in the DNAse mutant. V. parvula is an atypical Gram-negative Firmicute and it is a member of the oral and intestinal microbiota. Its ability to co-aggregate with multiple bacteria and to form biofilms is critical for colonization of its niches. However, molecular analysis in this species have been hampered by the lack of efficient genetic tools. Using a recently described naturally competent strain, I used random transposition and site-directed mutagenesis to show that trimeric autotransporters are the main adhesins of V. parvula SKV38, mediating cell-cell and cell-surface adhesion. Moreover, I identified a putative HD phosphohydrolase that is involved in autotransportermediated biofilm formation. The identification of biofilm formation determinants in the non-models anaerobic bacteria B. thetaiotaomicron and V. parvula constitutes a first step that will allow us to address the contribution of biofilms to gut microbiota colonization and function.Le microbiote intestinal humain constitue une structure anaérobie multi-espèces dense semblable à un biofilm où il a été supposé que l'adhésion soit cruciale pour la colonisation, l'entretien et le fonctionnement des bactéries. Cependant, les modèles classiques de formation de biofilms sont soit des membres mineurs du microbiote intestinal, souvent étudiés en présence d'oxygène, soit des bactéries intestinales pathogènes. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé des cribles génétiques pour identifier les déterminants de la formation de biofilms in vitro chez deux symbiotes intestinaux strictement anaérobies, Bacteroides thetaiotaomicron et Veillonella parvula. B. thetaiotaomicron est l'un des symbiotes à Gram-négatifs les plus abondants du microbiote intestinal humain. Bien que plusieurs isolats cliniques de B. thetaiotaomicron produisent des biofilms, la souche de référence génétiquement manipulable VPI 5482 forme peu de biofilm in vitro. J'ai montré que la délétion de la capsule 4, un des 8 polysaccharides capsulaires (CPS) de B. thetaiotaomicron, conduit à la genèse d'une sous-population de cellules acapsulées qui ont une forte capacité de formation de biofilms. Alors que l'expression de la plupart des capsules de B. thetaiotaomicron masque la formation de biofilms, l'expression de la capsule 8 induit la formation de biofilms, ce qui suggère qu'elle pourrait directement favoriser l'adhésion. Collectivement, ces résultats montrent que l'expression des CPS est un déterminant majeur de la formation de biofilms chez B. thetaiotaomicron. J'ai également montré que l'ajout d'extrait de bile ou de taurolithocholate induisait la formation d'un biofilm chez la plupart des isolats de B. thetaiotaomicron. La formation de biofilm induite par la bile implique une DNAse sécrétée potentielle. De façon cohérente, l'ajout d'une DNAse commerciale dans le milieu de culture restore la formation de biofilm en présence de bile du mutant délété pour la DNAse. V. parvula est un Firmicute à Gram-négatif atypique et il fait partie du microbiote oral et intestinal. Sa capacité à coagréger avec de multiples bactéries et à former des biofilms est essentielle pour sa colonisation. Cependant, chez cette espèce l'analyse moléculaire a été entravée par le manque d'outils génétiques efficaces. En utilisant une souche naturellement compétente récemment décrite, j'ai utilisé la mutagénèse par transposition aléatoire et dirigée pour montrer que les autotransporteurs trimériques sont les principales adhésines de V. parvula SKV38, assurant l'adhésion cellule-cellule et cellule-surface. De plus, j'ai identifié une phosphohydrolase HD supposée être impliquée dans la formatio de biofilms médiée par les autotransporteurs. L'identification des déterminants de la formation de biofilms dans les bactéries anaérobies non modèles B. thetaiotaomicron et V. parvula constitue une première étape qui nous permettra d'aborder la contribution des biofilms à la colonisation et au fonctionnement des microbiotes intestinaux