Desenvolvimento de bioprocessos para produção, caracterização e purificação de proteases de Penicillium sp, por fermentação no estado sólido

Orientador: Prof. Dr. Carlos Ricardo SoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Curso de Pós-Graduação em Processos BiotecnológicosInclui referências: p. 132-142Área de concentração: AgroindústriaResumo: Resíduos agroindustriais se constituem em substratos de grande potencial para serem utilizados como meio de cultivo na produção de inúmeros bioprodutos celulares de interesse comercial. Neste trabalho demonstrou-se a importância da fermentação no estado sólido na produção de enzimas proteolíticas. As proteases possuem ampla aplicação nas indústrias do couro, alimentícia e na fabricação de detergentes. O resíduo utilizado neste trabalho como substrato-suporte, foi o farelo de soja. Os resultados mostraram que o fungo Penicillium sp, foi selecionado como bom produtor de enzimas proteolíticas em farelo de soja com a umidade de 55 %, solução tampão citrato-fosfato pH 5,0 (0,2 M) e temperatura de 28 °C no período de 48 horas. O perfil respirométrico foi avaliado, sendo caracterizado como um processo aeróbio de produção de proteases, sendo que o fator aeração (65 mL/min/coluna) aumentou a produção de enzimas. O perfil de crescimento pode-ser avaliado pela determinação da glicosamina presente no micélio do Penicillium sp. A protease extra-celular obtida, no processo fermentativo, foi analisada através de métodos analíticos e avaliada através de parâmetros cinéticos. Os resultados demostraram que a protease apresentou melhor atividade enzimática utilizando-se como substrato a azocaseína, com um pH ótimo de 6,5 em tampão fosfato (0,2 M) e temperatura de 45 °C. Os estudos de estabilidade ao pH, apresentaram uma ampla faixa de pH (6-9). Os estudos de termoestabilidade revelaram temperaturas altas, em torno de 35 °C -45 °C. A atividade é reduzida na presença de íons Co+2, Mg+2 e Zn+2, enquanto na presença do Ca+2 e Na+ houve um discreto aumento na atividade proteolítica. A protease foi classificada como sendo uma serina protease, inibida cerca de 93% de sua atividade por PMSF, tendo um valor de Km app= 2,66 mg/mL. A protease foi compatível aos detergentes comerciais retendo cerca de 60 % de sua atividade em 60 minutos. A enzima apresentou boa estabilidade frente a agentes oxidantes e surfactantes, sugerindo a possibilidade de aplicação em indústria de detergentes. Os estudos de purificação revelaram a presença de duas proteases serínicas, isoenzimas, com ponto isoelétrico idênticos, sendo caracterizadas pela massa molecular de 16 e 38 kda.Abstract: Agro-industrial residues, which represent raw materials of low cost, often contain all the nutrients required for microbial growth. Solid State Fermentation (SSF) offers substantial advantages, such as superior enzyme productivity, process simplicity, lower capital investment and energy requirements, on production of different cellular metabolites of commercial interest. In this work the importance of solid state fermentation was demonstrated in the production of proteolytic enzymes. Proteases possess wide applications in the food industries and in the production of detergents. The substratesupport used in this work was soybean waste. The results showed that the strain of Penicillium sp. selected was a good proteolytic enzymes producer in the substratesupport with: humidity of 55%, citrate-phosphate buffer, pH 5,0 (0,2 M) and a temperature of 28 °C over a period of 48 hours. The respirometric profile was evaluated resulting in a aerobic process of proteases production. The best aeration for enzymes production was found to be 65 mL/min/column. The growth profile was evaluated through the determination of the glucosamine present in the mycelium of the Penicillium sp. Extra-cellular protease obtained in this fermentative process, was analysed through analytic methods and evaluated through kinetic parameters. The results showed that proteases presented better enzymatic activity when azocasein was used as substrate, with a pH of 6,5 in phosphate buffer (0,2 M) and a temperature of 45 °C. The studies of pH stability, showed that the enzyme was stable a pH range of 6 to 9. Stability studies revealed high temperatures, around 35° C -45 °C. The activity is reduced in the presence of Co+2 , Mg+2 and Zn+2 ions, while in the presence of Ca+2 and Na+r esulted in a discreet increase in proteolytic activity. Proteases were classified as serine proteases and were inhibited to about 93% by PMSF, with a value of app Km = 2,66 mg/mL. Proteases were compatible with commercial detergents retaining about 60% of their activity for6 0 minutes. The enzymes presented good stability towards oxidants and surfactant agents, suggesting the possibility for industrial use as detergents. Purification studies revealed the presence of two serine proteases, isoenzymes, with identical isoeletric point, being characterised by a molecular weight of 16 and 38 kda, respectively