Caracterización de las bases genéticas y moleculares de dos nuevos síndromes asociados a alteraciones del desarrollo

Tesis doctoral.-- Universidad Autónoma de Madrid. Departamento de Bioquímica.La existencia de un diagnóstico certero de una enfermedad es clave para la calidad de vida del paciente. En el caso de las enfermedades raras, la obtención de este diagnóstico puede transformarse en una odisea de varios años, e incluso décadas, que deriva en el retraso de la obtención de un posible tratamiento efectivo, una asistencia adecuada, así como la planificación de la vida familiar. El objetivo de esta tesis consistió en determinar la implicación de variantes genéticas identificadas mediante secuenciación de exoma en FXR1 y MAPKAPK5 como causantes de dos enfermedades raras hereditarias de manifestación pediátrica, a través de estudios funcionales en modelos experimentales que permitiesen conocer la patología molecular asociada a estas variantes. FXR1 codifica una proteína de unión a ARN. Este gen da lugar a 7 isoformas diferentes mediante splicing alternativo, siendo algunas específicas de tejido. En el músculo esquelético y cardiaco solo existen las isoformas e y f, que incorporan un exón 15 exclusivo de estos tejidos. FXR1 ha sido asociado previamente con defectos en el desarrollo muscular en modelos animales con este gen silenciado, asi como letalidad neonatal en ratones knockout constitutivos para todas las isoformas de Fxr1. En esta tesis, se estudió la historia natural de la enfermedad resultante de mutaciones recesivas que afectan exclusivamente a las isoformas musculares de FXR1, a través de: i) el análisis de dos líneas de ratón con mutaciones en el exón 15 de Fxr1 generadas por la tecnología CRISPR-Cas9, las cuales desarrollan miopatías no letales que varían en gravedad dependiendo del efecto de cada mutación en la proteína, y ii) el análisis de la expresión y la localización de las proteínas codificadas por FXR1 en cultivos de mioblastos de un paciente con mutaciones en las isoformas musculares de este gen. El resultado de estos estudios ha demostrado que determinadas mutaciones de FXR1 dan lugar a isoformas musculares e y f se acumulan en gránulos citoplasmáticos con forma anular en miotubos en cultivo y en fibras musculares. Estos gránulos no son gránulos de estrés ni agresomas, pero conservan la capacidad de unir ARNm. El análisis transcriptómico del músculo esquelético de los ratones con mutaciones en exón 15 de Fxr1, demostró la existencia de alteraciones en varias vías de señalización, como las proteínas de la vía de señalización de p53, genes proinflamatorios y proapoptóticos, y transcritos correspondientes a proteínas implicadas en la homeostasis del Ca2+ en el músculo esquelético. MAPKAPK5 codifica la proteína quinasa MK5 cuya activación depende de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs). Según la literatura, MK5 está implicada en procesos neurológicos, de supresión de tumores, angiogénesis y algunas funciones cardiacas. En esta tesis se identificaron mutaciones bialélicas en MAPKAPK5 como causa de un nuevo síndrome que engloba alteraciones del desarrollo neurológico y cardiaco y anomalías faciales junto con simpolidactilia. Asimismo, en este trabajo, se llevaron a cabo estudios funcionales en fibroblastos primarios de uno de los pacientes con mutaciones en este gen, en los que se demostró ausencia de MK5 y disminución de los niveles de ERK3, una de las proteínas reconocidas como interaccionantes con MK5. Estos estudios también pusieron de manifiesto que la capacidad de recuperación de los filamentos de actina en los fibroblastos primarios con mutaciones en MK5, previamente tratados con el inhibidor de la polimerización de la actina Latruculina-B, es menor que en células control, lo que está en consonancia con la hipótesis de que MK5 juegue un papel importante en la regulación del esqueleto de actina