Quantificação, caracterização molecular e agressividade do complexo de espécies Ralstonia solanacearum em Eucalyptus spp.

Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is a serious disease of eucalypt in humid and high temperature areas worldwide. The bacterium exhibits considerable variation in the host range, geographic origin, pathogenicity and physiological properties. Spreading of the bacterium in the field or to other eucalypt nurseries occurs mainly by infected but asymptomatic plant material. The use of pathogen-free propagating material as well as planting of resistant genotypes are currently the only strategies used for the disease control. Therefore, knowledge of the phylotype composition and genetic variability in populations of this bacterium is useful for implementing effective control measures. In this work, we developed an efficient intercalating dye-based real-time PCR protocol to detect the bacterium in asymptomatic eucalypt plants as well as to investigate its movement in tissues of clones with different levels of resistance. In addition, we identified phylotypes, sequevars and genotypes of 93 Ralstonia isolates, obtained from cuttings and eucalypt trees grown in different regions of Brazil. Subsequently, sequevar distribution patterns and their relationship with the aggressiveness of the bacterium in eucalypt clones were investigated. Through the real-time PCR technique, we found that the bacterium translocates acropetally and basipetally in inoculated but asymptomatic plants of the resistant clone as in plants of the symptomatic susceptible one. Nevertheless, a lower bacterial concentration was detected in the tissues of the resistant clone, where, through the scanning electron microscope, no bacterial biofilm was observed obstructing the xylem vessels. With the molecular characterization, we found that, like R. solanacearum (phylotype II), R. pseudosolanacearum (phylotype I) also causes eucalypt wilt. However, R. pseudosolanacearum is genetically uniform, which indicates a probable recent introduction of this phylotype in the country. Unlike R. pseudosolanacearum, R. solanacearum is phylogenetically diverse, and there is no correlation between sequevar and geographic origin. Isolate aggressiveness varied between the eucalypt clones tested, reinforcing the importance of conducting molecular and aggressiveness characterizations of the pathogen population, in order to support the selection of resistant material. The qPCR method developed in this study could be valuable for pathogen detection during disease diagnosis as well as pathogen quantification in plant tissue. The present study expands the knowledge of the variability of the Ralstonia solanacearum species complex in Eucalyptus spp. Keywords: Bacterial wilt. Real time PCR. Eucalypt.A murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum é uma importante doença do eucalipto em regiões quentes e úmidas em todo o mundo. A bactéria exibe considerável variação quanto à gama de hospedeiros, origem geográfica, patogenicidade e às propriedades fisiológicas. A dispersão da bactéria para o campo ou para outros viveiros de eucalipto ocorre principalmente por material vegetal infectado, porém assintomático. O uso de material de propagação livre do patógeno, bem como o plantio de genótipos resistentes são atualmente as únicas estratégias utilizadas para o controle da doença. Portanto, o conhecimento dos filotipos e da variabilidade genética em populações dessa bactéria é importante para a implementação de medidas de controle eficientes. Neste trabalho, desenvolveu-se um eficiente protocolo de PCR em tempo real baseado em corante intercalante para detectar a bactéria em plantas assintomáticas de eucalipto, bem como investigar sua movimentação nos tecidos de clones com diferentes níveis de resistência. Além disso, identificamos filotipos, sequevares e genótipos de 93 isolados de Ralstonia, obtidos de mudas e árvores de eucalipto cultivadas em diferentes regiões do Brasil. Posteriormente, foram investigados os padrões de distribuição de sequevar e sua relação com a agressividade da bactéria em clones de eucalipto. Através da técnica de PCR em tempo real, observou-se que a bactéria translocou acropetal e basipetalmente em plantas inoculadas e assintomáticas do clone resistente, assim como em plantas sintomáticas do clone suscetível. No entanto, uma menor concentração bacteriana foi detectada nos tecidos do clone resistente, onde, por meio de microscopia eletrônica de varredura, não se observou biofilme bacteriano obstruindo os vasos do xilema. Por meio de análises moleculares, constatou-se que, assim como R. solanacearum (filotipo II), R. pseudosolanacearum (filotipo I) também causa murcha em plantas de eucalipto. Entretanto, R. pseudosolanacearum é geneticamente uniforme, o que indica uma provável recente introdução desse filotipo no país. Diferentemente de R. pseudosolanacearum, R. solanacearum é filogeneticamente diversa, e não há correlação entre sequevar e origem geográfica. A agressividade dos isolados variou entre os clones de eucalipto testados, o que reforça a importância da caracterização molecular e de estudos de agressividade da população do patógeno, a fim de embasar a seleção de material resistente. O método de qPCR desenvolvido neste estudo pode ser valioso para detecção do patógeno durante o diagnóstico da doença, assim como para sua quantificação nos tecidos da planta. O presente estudo expande o conhecimento da variabilidade genética do complexo de espécies de Ralstonia solanacearum em Eucalyptus spp. Palavras-chave: Murcha bacteriana. PCR em Tempo Real. Eucalipto