Edição genômica por CRISPR/Cas9 para as mucopolissacaridoses de modelos celulares ao desenvolvimento de novas terapias

A edição genômica consiste na modificação precisa de sequências de DNA. Com o intuito de desenvolver modelos celulares para as mucopolissacaridoses do tipo I e II (MPS I, MPS II), doenças causadas por deficiências em enzimas, gerando acúmulo de glicosaminoglicanos (GAGs), utilizamos o sistema CRISPR/Cas9 para induzir mutações em células HEK293. Obtivemos células nocautes para ambas as doenças, com níveis indetectáveis de enzima e acúmulo significativo de GAGs. Com a mesma metodologia, criamos um modelo de MPS II utilizando células SH-SY5Y, que constituem um modelo relevante para estudos fisiopatológicos. Nestas células, observamos alterações morfológicas condizentes com o fenótipo de MPS II, como aumento de autolisossomos e de mitocôndrias. Ao serem diferenciadas em neurônios, as células apresentaram densidade de neuritos diminuída. Além da geração de modelos celulares, a edição genômica pode ser a peça principal de novos produtos de terapia. Utilizando CRISPR/Cas9 e um vetor viral, editamos eficientemente células-tronco hematopoiéticas humanas saudáveis para superexpressarem alfa-Liduronidase, a enzima ausente na MPS I. Ao serem transplantadas em camundongos MPS I imunocomprometidos e pré-condicionados com bussulfano, as células editadas enxertaram eficientemente, chegando a mais de 90 % de quimerismo humano em alguns animais. Isso culminou na correção completa dos parâmetros bioquímicos avaliados nos tecidos viscerais. O uso de bussulfano, em comparação com a irradiação, aumentou significativamente a migração de células editadas ao sistema nervoso central, demonstrada pela atividade enzimática superior, com redução significativa de GAGs. Demonstramos, assim, que a edição genômica para terapia genica ex vivo é muito eficaz e promissora, com poucas lacunas a serem preenchidas em estudos pré-clínicos antes da tradução aos pacientes. Uma delas é a avaliação da eficácia e segurança em modelos animais imunocompetentes. Com vistas à continuidade do estudo, avaliamos e definimos o melhor protocolo de transplante em camundongos neonatos, cuja via de administração que apresenta maior alcance das células no cérebro foi definida como sendo a via retro-orbital. Conjuntamente, demonstramos que a edição genômica contribui não só para o estudo da fisiopatologia das doenças, como também pode atuar como agente terapêutico, sendo utilizada com eficiência em protocolos de terapia gênica.Genome editing is the precise modification of DNA sequences. Aiming at developing new cellular models for mucopolysaccharidosis type I and type II (MPS I, MPS II) – lysosomal diseases caused by enzyme deficiencies leading to glycosaminoglycan storage (GAGs) – we employed the CRISPR/Cas9 system to cause mutations in HEK293 cells. Knockout cells were obtained for both diseases, with undetectable enzyme levels and significant GAG storage. Using the same method, we developed a relevant MPS II cellular model using the SH-SY5Y line. In this model, morphologic alterations were pronounced and related to the MPS II phenotype, as increased autolysosomes and mitochondria. Moreover, upon differentiation into neurons, MPS II cells presented diminished neurite density. Besides developing cellular models, genome editing tools can be the main piece in new therapeutic products. Using CRISPR/Cas9 and a viral vector, we efficiently edited human hematopoietic stem cells to express alfa-L-iduronidase, the deficient enzyme in MPS I. Edited cells were transplanted in immunocompromised MPS I mice conditioned with busulfan, where they engrafted robustly, reaching over 90 % of human chimerism in few mice. Consequently, full biochemical correction was observed in visceral organs. Comparing to irradiation, conditioning with busulfan allowed significantly higher cell migration towards the central nervous system, as demonstrated by higher enzyme activity and significant reduction in GAG levels in the brain. Thus, we have demonstrated that genome editing for ex vivo gene therapy is efficient and a promising approach to be translated to clinic, with few gaps to be filled before. One of these gaps is the efficacy and safety in immunocompetent mice. To address this, we have evaluated the best protocol for cell transplantation into newborn mice. The administration route that presented the best outcome in delivering cell to the brain was the retroorbital; additionally, this was also easy to perform and had few failures. Together, we demonstrate that genome editing contributes not only to physiopathology studies but can also be used as a therapeutic agent in gene therapy protocols, with high efficiency in both tasks