Modulação de sinapses GABAérgicas com autoanticorpos de doentes epilépticos

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA epilepsia é uma doença crónica do cérebro caracterizada por crises/convulsões recorrentes que resultam de um desequilíbrio entre a excitação e a inibição neuronal, culminando numa sincronização excessiva da atividade neuronal. Foram definidas diversas etiologias para a epilepsia; no entanto, uma fração substancial dos pacientes tem epilepsia de etiologia desconhecida, dificultando não só o próprio diagnóstico como também a escolha das terapias mais adequadas. A identificação de autoanticorpos contra proteínas neuronais no soro de pacientes epiléticos refratários a fármacos antiepiléticos tem vindo a revolucionar o campo da epilepsia, definindo a autoimunidade como uma possível etiologia para a doença. Atualmente, a epilepsia autoimune é reconhecida como uma entidade clínica distinta. Contudo, os testes de diagnóstico utilizados para a deteção dos autoanticorpos estão limitados à sua disponibilidade comercial, falhando o diagnóstico dos doentes que apresentam autoanticorpos não testados no protocolo de diagnóstico clínico padrão. Embora rara, a encefalite associada a anticorpos contra o recetor GABA de tipo A (GABAAR) é um dos tipos mais graves e desafiantes de encefalite descrita, relacionada com episódios severos de crises epiléticas refratárias. Os GABAAR desempenham um papel central na regulação da excitabilidade cerebral, sendo os principais mediadores da neurotransmissão inibitória rápida no cérebro adulto, altamente desregulada na epilepsia. No entanto, devido à sua raridade e descoberta recente, a identificação clínica de autoanticorpos contra os GABAAR é incomum, e a compreensão dos mecanismos moleculares por eles mediados é ainda limitada e incerta.Assim, neste trabalho, foi utilizada uma combinação de testes funcionais, moleculares e de caracterização de modo a identificar o efeito dos autoanticorpos contra os GABAAR em culturas neuronais de hipocampo de rato. Em resumo, foram incubados neurónios de hipocampo em cultura com amostras de soro de doentes contendo anticorpos anti-GABAAR e a atividade da rede neuronal foi analisada utilizando matrizes de microeléctrodos (MEA). Os resultados revelaram um aumento da excitabilidade e da ritmicidade da rede neuronal. Este tipo de atividade é comparável com a atividade cerebral observada nas convulsões clínicas em doentes com epilepsia. Além disso, identificámos um mecanismo de internalização dos anticorpos anti-GABAAR em neurónios do hipocampo em cultura, que precede o aparecimento das alterações funcionais. Isto sugere um efeito patogénico dos autoanticorpos anti-GABAAR mediado pela sua internalização. Adicionalmente, a incubação de neurónios de hipocampo em cultura com soro contendo autoanticorpos contra os GABAAR durante 1h aumentou significativamente a expressão na membrana neuronal dos recetores GABAA contendo as subunidades α1 e γ2, sugerindo um mecanismo inicial de “crosslink”, seguido por um aumento da taxa de internalização dos GABAAR, como revelado pelo ensaio de fluorescência para internalização dos GABAAR após 3h de incubação com as mesmas amostras. O objetivo da segunda deste trabalho foi a identificação e caracterização de autoanticorpos contra antigénios da superfície neuronal em amostras de soro de doentes epiléticos com suspeita de etiologia autoimune. As 17 amostras identificadas como positivas, foram depois submetidas a imunoprecipitação dos imunocomplexos e enviadas para análise por espectrometria de massa, com o objetivo de identificar autoantigénios relevantes. Em suma, neste trabalho descrevemos mecanismos patogénicos mediados por autoanticorpos contra os GABAAR que podem estar na base da epileptogénese na encefalite associada a autoanticorpos anti-GABAAR. Tais descobertas podem ser os motores para o futuro desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a epilepsia apontando para a preservação da neurotransmissão GABAérgica, com o objectivo de melhorar a qualidade de vida destes doentes.Epilepsy is a chronic disorder of the brain characterized by recurrent seizures that result from an imbalance between excitation and inhibition, culminating in excessive synchronization of neuronal activity. Numerous epilepsy aetiologies have been defined; however, a substantial proportion of patients still have unknown epilepsy aetiology, hindering the diagnosis and choice of the most appropriate treatment. The identification of circulating autoantibodies against neuronal proteins in the serum of epileptic patient’s refractory to antiepileptic drugs (AED) treatment revolutionized the epilepsy field, defining autoimmunity as a possible aetiology. Nowadays, autoimmune epilepsy has already been recognized as a distinct clinical entity. Nevertheless, the diagnostic tests used for autoantibody detection are limited to their commercial availability, failing the diagnosis of patients presenting autoantibodies not tested in the standard clinical diagnostic protocol. Although rare, GABAA receptor (GABAAR)-associated encephalitis is one of the most severe and challenging types of encephalitis described, related to severe refractory seizure episodes. GABAAR play a central role in the regulation of brain excitability, being the major mediators of fast inhibitory neurotransmission in the adult brain, highly downregulated in epilepsy. Yet, due to their rarity and quite recent discovery, the clinical identification of GABAAR-autoantibodies is unusual, and the understanding of their mediated molecular mechanisms is still limited and uncertain.Therefore, in this work, a combination of functional, molecular, and characterization analyses were performed in order to uncover the effect of anti-GABAAR-autoantibodies on rat hippocampal neuronal cultures. Briefly, patient’s serum samples containing anti-GABAAR antibodies were used to incubate hippocampal neuronal and the analysis of neuronal network activity using microelectrode arrays (MEA), showed an increase in the strength and rhythmicity of networks excitability and connectivity, resembling patients’ clinical seizures. Furthermore, we disclosed a mechanism of internalization of anti-GABAAR-autoantibodies in hippocampal neurons preceding the observed functional alterations, pointing to a pathogenic effect of GABAAR-autoantibodies mediated by their internalization. Additionally, the incubation of hippocampal neuronal in culture with the serum containing GABAAR-autoantibodies during 1h significantly increased α1- and γ2-GABAAR clusters at the neuronal plasma membrane, suggesting an initial cross-link mechanism, followed by an increase in GABAAR internalization rate, as revealed by a fluorescence assay for GABAAR receptor internalization after 3h incubation with the same samples. In the second part of this work, we focused on identifying and characterizing autoantibodies targeting neuronal cell-surface antigens in sera samples of epileptic patients suspected of autoimmune aetiology. The 17 positive samples identified, were then subjected to the immunoprecipitation of the immunocomplexes in order to identify relevant autoantigens by mass spectrometry. Overall, in this work showed pathogenic mechanisms mediated by anti-GABAAR autoantibodies that might be on the basis of epileptogenesis in anti-GABAAR associated encephalitis. These findings may be the drivers for the future development of new antiepileptic strategies pointing to the preservation of GABAergic neurotransmission, which could highly improve the quality of patients’ life.Outro - Este trabalho foi financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), através do Programa Operacional Regional Centro 2020 no âmbito do projecto CENTRO-01-0145-FEDER-030659 e através do Programa Operacional COMPETE 2020-Operacional para a Competitividade e Internacionalização e fundos nacionais portugueses através da FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020 e LA/P/0058/2020, e pela Liga Portuguesa Contra a Epilepsia (LPCE)