Development of Wound Dressings with High Oxygenation Capacity and Photodynamic Antimicrobial Properties

Trabalho de Projeto do Mestrado em Engenharia Biomédica apresentado à Faculdade de Ciências e TecnologiaUma das principais complicações associadas à cicatrização de feridas é o aparecimento de infeções. Neste sentido, os antibióticos têm desempenhado um papel crucial, tratando as infeções provocadas por bactérias patogénicas. Contudo, o abuso destes medicamentos, tem levantado sérios problemas, no que concerne ao surgimento de novas estirpes bacterianas resistentes a antibióticos. Isto revela a necessidade de desenvolver novos agentes antimicrobianos altamente eficazes. Deste modo, a terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT), afirma-se como uma alternativa aos métodos tradicionais usados para a inativação microbiana, onde, através da utilização de uma fonte de luz de características conhecidas, por intermédio de uma série de processos físico-químicos, se induz a morte de bactérias. Porém, a aplicação desta estratégia no tratamento de feridas ainda apresenta algumas limitações, que se prestam a ser objetos de investigação futura. Por conseguinte, o trabalho apresentado consiste no desenvolvimento e caracterização de uma nova abordagem de pensos para feridas, com propriedades antimicrobianas, pela ação fotodinâmica, e que, ao possuir elevada capacidade de oxigenação, promova o processo de cicatrização. O sistema desenvolvido resulta da incorporação de nanocápsulas de sílica porosa (ncSi) numa matriz polimérica à base de gelatina metacrilada (Gel-MA). As ncSi são compostas por um núcleo, que contém curcumina (fotossensibilizador – PS – natural) dissolvida num de três líquidos iónicos (IL), confinado por um invólucro de sílica porosa, sintetizado através de um método sol-gel, partindo de uma microemulsão IL/água. Os IL escolhidos ([BMPYRR][NTf2], [OMIM][NTf2], [P6,6,6,14][NTf2]), além de serem hidrofóbicos e conseguirem solubilizar o PS em estudo, possuem capacidades de absorção e libertação de gases, nomeadamente O2. Relativamente à matriz polimérica, esta foi obtida da modificação química da gelatina (material com boas biocompatibilidade, biodegradabilidade e bioatividade) pela introdução de grupos metacrilados, com o intuito de fotorreticular as cadeias poliméricas. Após a síntese e processamento dos três tipos de nanocápsulas, verificou-se que a encapsulação do IL no interior das ncSi foi bem-sucedida para os três IL. Na caracterização experimental destes nanomateriais. a composição química foi avaliada através de análise termogravimétrica (TGA) e análise elementar, e indicou que os três tipos de ncSi são maioritariamente constituídos por IL, sendo que dos três tipos de ncSi, as BMPYRR-CUR@ncSi apresentam a menor percentagem de IL. A caracterização morfológica foi realizada por microscopia eletrónica de varrimento (SEM) e microscopia eletrónica de varrimento por transmissão (STEM), onde se confirmou a escala nanométrica dos materiais e se comprovou a sua estrutura capsular. Nos ensaios de oxigenação, foi comprovada a sua capacidade em capturar e libertar oxigénio molecular. Por fim, avaliou-se, por métodos diretos e indiretos, a capacidade de geração de oxigénio singleto pelas nanocápsulas, quando irradiadas com luz de comprimento de onda adequado. Paralelamente, prepararam-se filmes de Gel-MA incorporando-se as ncSi previamente preparadas. A caracterização por SEM corroborou o sucesso e a homogeneidade da distribuição das ncSi pela matriz polimérica. Finalmente, aferiu-se a atividade antimicrobiana dos filmes de Gel-MA com ncSi imobilizadas, através da comparação entre as curvas de crescimento de populações de bactérias probióticas (lactobacilos), após contacto com os filmes e irradiação com luz azul. Os resultados deste ensaio simples, permitiram comprovar indiretamente que, na prática, o sistema em estudo cumpre o seu propósito, exercendo efeito antibacteriano pela PDT, concluindo-se que os tratamentos induziram alterações nas populações bacterianas. O efeito foi significativo para 120 minutos de exposição à luz azul, e foi muito evidente nos filmes que resultaram da incorporação de BMPYRR-CUR@ncSi e de P6,6,6,14-CUR@ncSi. O conjunto de resultados obtidos parece indicar que, dos três IL em estudo, o mais favorável para a aplicação discutida é o [BMPYRR][NTf2]. As ncSi preparadas com este IL apresentam características que permitem uma difusão rápida do oxigénio singleto gerado, para o meio no qual está o alvo biológico, e um bom carregamento com oxigénio. Com este trabalho ficou comprovado que é possível encapsular um IL hidrofóbico em ncSi, usando técnicas de microemulsão com um sistema de surfactantes adequado, e métodos sol-gel em meio aquoso. Foi demonstrado, também, que as nanocápsulas apresentam caraterísticas favoráveis para a sua aplicação em PDT e que o sistema resultante da imobilização das ncSi num filme de Gel-MA pode ser uma alternativa interessante no combate às infeções bacterianas. Espera-se que, num futuro próximo, estudos adicionais em bactérias patogénicas ou sistemas in vivo, possam demonstrar o potencial destes novos materiais nas aplicações previstas.Infections are one of the main problems related to wound healing. In this sense, antibiotics have played a crucial role in the treatment of pathogenic bacteria infections. However, the excessive use of such drugs has become a serious problem, namely because of the emergence of antibiotic-resistant bacteria strains. So, it is necessary to develop new and highly effective antimicrobial agents. Therefore, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is an interesting alternative to microbial inactivation traditional methods. This technique uses a light source with known characteristics and, through a series of physicochemical processes, is capable of induce bacterial death. Nevertheless, some limitations are still associated with the application of this strategy in wound healing, that will be subject of future investigations. Thus, the presented work aims the development and characterization of a new wound dressing approach, that besides having antimicrobial properties by photodynamic inactivation has improved oxygenation ability. To prepare the proposed wound dressing, porous silica nanocapsules (ncSi) were incorporated in a methacrylated gelatin (Gel-MA) matrix. ncSi are composed by a nucleus of curcumin (natural photosensitiser – PS) dissolved in one of three ionic liquids (IL), confined in a shell of porous silica synthetized by a sol-gel technique, starting with an IL/water microemulsion. Apart of their hydrophobicity and their curcumin solubilization capabilities, the chosen IL ([BMPYRR][NTf2], [OMIM][NTf2], [P6,6,6,14][NTf2]) have the ability to capture and release various types of gases, namely O2. Regarding the polymeric matrix, it was obtained by chemical modification of gelatin (material with distinctive properties, such as biocompatibility, biodegradability, and bioactivity), by the insertion of methacrylated groups, in order to obtain photo crosslinking polymeric chains. After synthesising and processing three types of ncSi, it was noticed that all of three IL were successfully encapsulated inside the nanocapsules. Then, these nanomaterials were characterized. Chemical composition was assessed either through thermogravimetric analysis (TGA) and elemental analysis and showed that the three types of nanocapsules are mainly composed by IL, whereas BMPYRR-CUR@ncSi present the lower percentage of IL. Morphological characterization was carried through scanning electron microscopy (SEM) and scanning transmission electron microscopy (STEM), which have corroborated the nanometric scale of materials as well as its capsular structure. In oxygenation assays, it was proved their abilities to absorb and release molecular oxygen. Finally, capacity to singlet oxygen production by ncSi when irradiated with a suitable wavelength was detected by direct and indirect methods. Simultaneously, Gel-MA films were prepared, incorporating the prepared ncSi. SEM characterization revealed that ncSi were effectively and homogeneously distributed in polymeric matrix. Ultimately, the antimicrobial activity of Gel-MA films with immobilized ncSi was evaluated by comparing the growth curves of probiotic bacteria populations (lactobacillus), after being in contact with the film and/or exposed to blue light. Results of this simple test allowed to indirectly confirm the practical purpose of the developed wound dressing, which is to exert an antibacterial effect through PDT. Results showed changes in bacterial populations that were induced by applied treatments. Significant negative effects were obtained for 120 minutes of blue light exposure and were obvious for films with BMPYRR-CUR@ncSi and P6,6,6,14-CUR@ncSi incorporation. The set of obtained results suggest that, of the three studied IL, [BMPYRR][NTf2] is the most favourable to the discussed application. ncSi prepared with this IL present characteristics that enable a quick diffusion of the generated singlet oxygen, to the environment where it is the biological target, as well as an improved oxygen loading. This work proves that it is possible to encapsulate a hydrophobic IL into porous silica nanocapsules, combining microemulsion techniques with an adequate surfactant system and aqueous sol-gel methods. It was also proved that those nanocapsules presented some favourable properties to be applied in PDT; the proposed wound dressing resulting from ncSi immobilization in a Gel-MA film could also be an interesting alternative to treat bacterial infections. It is expected that future studies in pathogenic bacteria or in in vivo systems, will prove the potential of these new materials for the envisaged applications