Analysis of the functional involvement of mitochondrial homeostasis regulators in aging and age-related diseases

The survival of organisms depends on the ability to regulate their metabolism to produce energy and regulate cellular responses to stressors to maintain the integrity and functionality of their biomolecules (eg, genome, proteome). At the organismal level, these responses require overly complex, still largely unknown, interconnections and inter-regulations of cell-autonomous and non-autonomous mechanisms. In this setting, mitochondria have critical anabolic and catabolic functions to metabolize nutrients and adjust cellular physiology through the operation of the protein machinery for oxidative phosphorylation (OXPHOS) for energy production. Therefore, the number of mitochondria and the correlation of their activity with the cellular mechanisms that regulate growth, nutrient availability, and cell homeodynamics are tightly regulated. However, the mechanistic details of these processes remain unknown.Mitochondria consist of two membranes, the Outer Mitochondrial Membrane (OMM) and the Inner Mitochondrial Membrane (IMM). Being dynamic cellular structures, mitochondria rapidly remodel their shape and size through the processes of fusion and fission. In mammals, the fusion process is regulated by the proteins Mfn1, Mfn2, and Opa1. Mfn proteins participate in OMM fusion, while Opa1 is involved in IMM fusion and cristae remodeling. Mitochondrial fusion is an evolutionarily conserved process that enables the change of mitochondrial structure as well as the exchange of mitochondrial material. The Opa1 protein is essential for the completion of the fusion, allowing the fusion of the IMM, the regulation of the biogenesis and cristae remodeling of the mitochondrial, and the release of cytochrome c during apoptosis. Fission is the other dynamic process of mitochondria, by which two or more mitochondria are created – a major mediator of fission is the Drp1 protein. Mitochondrial mass and activity must be adjusted in response to the regulation of tissue homeostasis, cell growth rates, and nutrient availability. In mammals, the transcriptional coactivator PGC-1α (PPARγ coactivator 1) and its homologs PGC-1β and PRC regulate multiple metabolic processes, including mitochondrial biogenesis. PGC-1 family members regulate mitochondrial biogenesis by co-activating the nuclear transcription factors Nrf2, Estrogen-Related Receptor-α (ERRα), and YY1, to enhance the expression of mitochondrial protein-coding genes. A unique homolog of the PGC family genes, Spargel (srl), is expressed in D. melanogaster. Of note, the lack of gene redundancy (multiple isoforms of the same gene) present in D. melanogaster makes it an ideal model system for determining the effects of reduced or increased expression levels of srl on the whole organism.The stability of the proteome is ensured by the proteostasis network (PN), an integrated modular system that ensures protein quality control both under normal conditions and under conditions of increased proteotoxic stress. Key components of the PN are the molecular machinery of protein synthesis and peptide sorting/trafficking, the endoplasmic reticulum (ER), the endoplasmic reticulum-associated protein degradation (ERAD) system, molecular chaperones, and the two main protein degradation machineries; the autophagy-lysosome (ALP) and the ubiquitin-proteasome (UPP) pathways. Proteasome function in D. melanogaster tissues is regulated by the cncC transcription factor, the ortholog of the mammalian Nrf2 transcription factor. Nrf2, along with Foxo and Hsf-1 play a central role in protecting the cell from oxidative damage. Nrf2 has also played a key role in maintaining mitochondrial structure and functionality by controlling ROS levels, affecting oxidative phosphorylation and ATP production, as well as fatty acid oxidation and mitochondrial biogenesis. In recent years, many studies from our laboratory and other research groups have revealed the critical role of the UPP in the quality control of mitochondrial function, since the proteasome not only removes damaged mitochondrial proteins but is also involved in the quality control of their synthesis.Thus, although mitostasis appears to be regulated by the proteostasis network, the effect of mitochondria on proteostasis has not been studied yet. Specifically, the response of the main proteolytic mechanisms after the disruption of mitostasis remains unknown. The work of this PhD Thesis, demonstrate the existence of inter-regulation of the proteostasis network by mitochondrial proteins (e.g., dynamics and biogenesis, involved in mitostasis) in Drosophila melanogaster.In a detailed work, we show that the genetic disruption of mitochondrial dynamics (knock-down of Opa1, Marf, Drp1) in Drosophila results in developmental lethality when induced in the early stages of life or significantly accelerates aging when induced after the metamorphosis stage. Disruption of mitochondrial dynamics is tolerated for a brief period in young adult insects but is accompanied by an increase in oxidative stress and proteome instability. This transient tolerance seems to originate from the mobilization of the stress sensors transcription factors Nrf2/cncC, foxo and the transcriptional co-activator srl to up-regulate cytoprotective antioxidant and proteostatic mechanisms. Also, suppression of mitochondrial fusion and fission appears to directly activate UPP and ALP in response to mitochondrial damage, while the opposite is observed after the upregulation of mitochondrial dynamic events. At the same time, we found that inhibition of proteasome functionality or silencing of Nrf2 and foxo transcription factors in young flies with disrupted mitochondrial dynamics has toxic effects. However, both overexpression of Nrf2 (with concomitant proteasome activation) and upregulation of the autophagic related protein Atg8a, could not improve flies’ viability – which instead was slightly improved after antioxidant administration.Additionally, we show the striking gender differences observed after Opa1 silencing. Mitochondria exhibit a strong sex differentiation, as they are inherited exclusively from the mother and exert different effects on males and females possibly due to different energy requirements and the composition of hormones. Male flies with IMM fusion suppression displayed a more severe disruption of mitochondria and muscle structure, reduced levels of mitochondrial respiration, and reduced longevity. Opa1 silencing also affected metabolism; flies presented altered glucose metabolism, lipid size and metabolic profile in a sex-dependent manner.Another finding of this Ph.D. Thesis is the participation of the transcriptional co-activator srl/Pgc-1α in the regulation of the UPP. Although srl/Pgc-1α interacts with cncC/Nrf2 to induce mitochondrial biogenesis, in the present work we show that the activation of the UPP (under conditions of srl overexpression) is not mediated by cncC/Nrf2. However, cncC/Nrf2 appears to be crucial for the regulation of mitochondrial gene expression, metabolism, mitochondrial respiration, and oxidative load. In addition, srl is shown to act complementary to cncC/Nrf2 to compensate for its genetic deficiency in maintaining mitostasis and improving flies’ longevity. Finally, we found that mitochondrial biogenesis is not favored under conditions of OMM but after IMM fusion suppression and that activation of srl leads to UPP upregulation, improvement of mitochondrial homeodynamics, and increased longevity.Taken together, our findings indicate that mitochondrial dysfunction has important implications in organismal physiology. Despite the immediate activation of cell-protective pathways, the system fails to balance and leads to a significant acceleration of aging. The activation of proteostatic mechanisms is crucial to lifespan and appears to be mediated by the action of the transcription factors cncC, foxo, and the transcriptional cofactor srl/ Pgc-1α. Overall, our findings indicate that the toxicity induced by mitochondrial dysfunction can be partially reduced by molecules with anti-aging or antioxidant activities or through activation of the srl transcription factor.Η επιβίωση των οργανισμών εξαρτάται από την ικανότητα ρύθμισης του μεταβολισμού τους προκειμένου να παράγουν ενέργεια, καθώς και από τη δυνατότητα ρύθμισης των κυτταρικών αποκρίσεων έναντι στρεσογόνων παραγόντων για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της λειτουργικότητας των βιομορίων τους (π.χ. γονιδίωμα, πρωτέωμα). Σε επίπεδο οργανισμού, αυτές οι αποκρίσεις απαιτούν εξαιρετικά περίπλοκες, σε μεγάλο βαθμό άγνωστες ακόμα, διασυνδέσεις και αλλήλο-ρυθμίσεις των αυτόνομων και μη αυτόνομων μηχανισμών των κυττάρων. Σε αυτή τη ρύθμιση, τα μιτοχόνδρια έχουν κρίσιμες αναβολικές και καταβολικές λειτουργίες για τον μεταβολισμό των θρεπτικών συστατικών και την προσαρμογή της κυτταρικής φυσιολογίας μέσω της λειτουργίας των πρωτεϊνικών μηχανών της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (OXPHOS) με σκοπό την παραγωγή ενέργειας. Ως εκ τούτου, ο αριθμός των μιτοχονδρίων αλλά και η συσχέτιση της ενεργότητας τους με τους κυτταρικούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν την ανάπτυξη, τη διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών και την ομοιοδυναμική του κυττάρου βρίσκονται υπό στενή ρύθμιση. Ωστόσο οι μηχανιστικές λεπτομέρειες των διαδικασιών αυτών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.Τα μιτοχόνδρια αποτελούνται από δύο μεμβράνες, την Εξωτερική Μιτοχονδριακή Μεμβράνη (ΕξΜΜ) και την Εσωτερική Μιτοχονδριακή Μεμβράνη (ΕσΜΜ). Όντας δυναμικές κυτταρικές δομές τα μιτοχόνδρια αναδιαμορφώνουν ταχέως το σχήμα τους και το μέγεθος τους μέσω των διαδικασιών σύντηξης και σχάσης. Στα θηλαστικά, οι διαδικασία της σύντηξης ρυθμίζεται από τις πρωτεΐνες Mfn1, Mfn2 και Opa1. Οι πρωτεΐνες Mfn εμπλέκονται στη σύντηξη της ΕξΜΜ, ενώ η Opa1 εμπλέκεται στη σύντηξη της ΕσΜΜ και στην αναδιαμόρφωση των ακρολοφιών. Η μιτοχονδριακή σύντηξη είναι μια εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία η οποία επιτρέπει την αλλαγή της μιτοχονδριακής δομής καθώς και την ανταλλαγή μιτοχονδριακού υλικού. Για την ολοκλήρωση της σύντηξης απαραίτητη είναι η πρωτεΐνη Opa1, η οποία επιτρέπει την σύντηξη της ΕσΜΜ, την ρύθμιση της βιογένεσης και αναδιαμόρφωσης των ακρολοφιών του μιτοχονδρίου και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c κατά τη διάρκεια της απόπτωσης. Η σχάση είναι το άλλο δυναμικό γεγονός των μιτοχονδρίων, μέσω του οποίου δημιουργούνται δύο ή περισσότερα μιτοχόνδρια – κύριος τελεστής της σχάσης είναι η πρωτεΐνη Drp1. Όπως αναφέρθηκε η μιτοχονδριακή μάζα και ενεργότητα πρέπει να αναπροσαρμόζονται ως αποτέλεσμα της ρύθμισης της λειτουργίας των ιστών, του ρυθμού κυτταρικής ανάπτυξης και της διαθεσιμότητας θρεπτικών συστατικών. Στα θηλαστικά, ο μεταγραφικός συν-ενεργοποιητής PGC-1α (PPARγ coactivator 1), καθώς και τα ομόλογά του PGC-1β και PRC, ρυθμίζουν πολλαπλές μεταβολικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μιτοχονδριακής βιογένεσης. Τα μέλη της οικογένειας PGC-1 ρυθμίζουν τη μιτοχονδριακή βιογένεση μέσω της συν-ενεργοποίησης των πυρηνικών μεταγραφικών παραγόντων Nrf2, του σχετιζόμενου με οιστρογόνα υποδοχέα-α (ERRα) και του YY1, για την ενίσχυση της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν τις μιτοχονδριακές πρωτεΐνες. Στην Drosophila melanogaster εκφράζεται ένα μοναδικό ομόλογο των γονιδίων της οικογένειας PGC, το spargel (srl). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι η έλλειψη γονιδιακού πλεονασμού (πολλαπλές ισομορφές του ίδιου γονιδίου) στη D. melanogaster τη καθιστά ιδανικό σύστημα μοντέλο για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων των μειωμένων ή αυξανόμενων επιπέδων έκφρασης του srl σε ολόκληρο τον οργανισμό.Η σταθερότητα του πρωτεώματος διασφαλίζεται από το δίκτυο της πρωτεόστασης (PN), ένα ολοκληρωμένο αρθρωτό σύστημα που διασφαλίζει τον ποιοτικό έλεγχο των πρωτεϊνών τόσο υπό φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες αυξημένου πρωτεοτοξικού στρες. Βασικά συστατικά του δικτύου πρωτεόστασης είναι οι μοριακές μηχανές πρωτεϊνικής σύνθεσης και διαλογής/διακίνησης πεπτιδίων, το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), το σύστημα απόκρισης στις μη σωστά διπλωμένες πρωτεΐνες του ενδοπλασματικού δικτύου (ERAD), οι μοριακές συνοδοί και οι δύο κύριες μηχανές αποικοδόμησης, δηλαδή τα μονοπάτια αυτοφαγίας-λυσοσώματος (ALP) και ουβικιτίνης-πρωτεασώματος (UPP). Η λειτουργία του πρωτεασώματος στους ιστούς της D. melanogaster, όπως και στους περισσοτέρους οργανισμούς, ρυθμίζεται από τον μεταγραφικό παράγοντα cncC, που είναι λειτουργικά παρόμοιος με τον μεταγραφικό παράγοντα Nrf2 των θηλαστικών. Ο Nrf2, μαζί με τους Foxo και Hsf-1 παίζουν κεντρικό ρόλο στην προστασία του κυττάρου από οξειδωτική βλάβη. Ο Nrf2 εμπλέκεται επίσης στην διατήρηση της δομής και της λειτουργικότητας των μιτοχονδρίων καθώς ελέγχει τα επίπεδα των ROS, επηρεάζει την οξειδωτική φωσφορυλίωση και την παραγωγή ATP, καθώς και την οξείδωση των λιπαρών οξέων και την βιογένεση των μιτοχονδρίων. Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες τόσο από το εργαστήριο μας όσο και από άλλες ερευνητικές ομάδες, δεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο του UPP στον ποιοτικό έλεγχο της λειτουργίας των μιτοχονδρίων καθώς το πρωτεάσωμα όχι μόνο απομακρύνει τις κατεστραμμένες μιτοχονδριακές πρωτεΐνες, αλλά εμπλέκεται και στον ποιοτικό έλεγχο της σύνθεσης αυτών.Παρόλο λοιπόν που η μιτόσταση φαίνεται να ρυθμίζεται εν μέρει από το δίκτυο της πρωτεόστασης, η αντίστροφή λειτουργική συσχέτιση δεν έχει μελετηθεί. Συγκεκριμένα, η ανταπόκριση των κύριων πρωτεολυτικών μηχανισμών σε συνθήκες διαταραχής της μιτόστασης παραμένει άγνωστη. Στο πλαίσιο της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής μελετάται και αποδεικνύεται η ύπαρξη αλληλο- ρύθμισης του δικτύου της πρωτεόστασης με τα μιτοχονδριακά δυναμικά (κομμάτι της μιτόστασης) στη Drosophila melanogaster καθώς και η συμμετοχή του μεταγραφικού συν-παράγοντα srl/Pgc-1α στην ρύθμιση του δικτύου της πρωτεόστασης.Ειδικότερα το πλαίσιο της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής δείχθηκε ότι η γενετική διαταραχή των μιτοχονδριακών δυναμικών (καταστολή έκφρασης των Opa1, Marf, Drp1) στην Drosophila επάγει αναπτυξιακή θνησιμότητα όταν προκαλείται στα πρώτα στάδια της ζωής ή επιταχύνει σημαντικά την γήρανση όταν επάγεται μετά το στάδιο της μεταμόρφωσης. Η διαταραχή των μιτοχονδριακών δυναμικών είναι ανεκτή για μια μικρή περίοδο στα νεαρά ενήλικα έντομα, η οποία όμως συνοδεύεται από αύξηση του οξειδωτικού στρες και της πρωτεωμικής αστάθειας. Η παροδική αυτή ανοχή φαίνεται να προέρχεται από την κινητοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων Nrf2/cncC και foxo και του μεταγραφικού συν-ενεργοποιητή srl για την αυξο-ρύθμιση κυτταρο-προστατευτικών αντιοξειδωτικών και πρωτεοστατικών μηχανισμών. Επίσης η καταστολή της μιτοχονδριακής σύντηξης και σχάσης φαίνεται να ενεργοποιεί άμεσα το UPP και ALP ως απόκριση στη μιτοχονδριακή βλάβη, ενώ το αντίθετο παρατηρείται ύστερα από επαγωγή των μιτοχονδριακών δυναμικών. Παράλληλα βρέθηκε ότι η αναστολή της λειτουργικότητας του πρωτεασώματος ή η αποσιώπηση των Nrf2 και foxo μεταγραφικών παραγόντων σε νεαρά έντομα με διαταραγμένα μιτοχονδριακά δυναμικά προκαλεί σημαντική αύξηση της τοξικότητας. Παρόλα αυτά τόσο η υπερέκφραση του Nrf2 (με ταυτόχρονη ενεργοποίηση του πρωτεασώματος) όσο και η αυξο-ρύθμιση του αυτοφαγικού γονιδίου Atg8a δεν είναι σε θέση να βελτιώσουν τη βιωσιμότητα των εντόμων, η οποία φαίνεται να βελτιώνεται ελαφρά ύστερα από χορήγηση αντιοξειδωτικών.Επιπρόσθετα, δείχνουμε τις εντυπωσιακές διαφοροποιήσεις μεταξύ των φύλων που παρατηρούνται ύστερα από αποσιώπηση της Opa1. Τα μιτοχόνδρια παρουσιάζουν μια έντονη διαφοροποίηση ανάλογα με το φύλο, καθώς κληρονομούνται αποκλειστικά από τη μητέρα και ασκούν διαφορετικές επιδράσεις σε αρσενικά-θηλυκά, πιθανότητα λόγω των διαφορετικών ενεργειακών απαιτήσεων αλλά και της σύνθεσης των ορμονών. Βρέθηκε ότι τα αρσενικά έντομα με καταστολή σύντηξης της ΕσΜΜ παρουσιάζουν πιο σοβαρή διαταραχή των μιτοχονδρίων, της μυϊκής δομής, μειωμένα επίπεδα κυτταρικής αναπνοής και μειωμένη μακροζωία. Επιπρόσθετα, βρέθηκε ότι η αποσιώπηση της Opa1 μεταβάλλει με φυλο-εξαρτώμενο τρόπο τον μεταβολισμό της γλυκόζης, το μέγεθος των λιπιδίων και το μεταβολικό προφίλ των εντόμων.Ένα ακόμη εύρημα της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η συμμετοχή του μεταγραφικού συν- ενεργοποιητή srl/Pgc-1α στην ρύθμιση του UPP. Δεδομένης της αλληλεπίδρασης του srl/Pgc-1α με τον μεταγραφικό παράγοντα Nrf2/cncC για την επαγωγή της μιτοχονδριακής βιογένεσης, στην παρούσα εργασία δείχνουμε ότι η ενεργοποίηση του UPP υπό συνθήκες υπερέκφρασης του srl δεν τελείται από τον cncC/Nrf2. Εντούτοις ο cncC/Nrf2 φαίνεται να είναι καθοριστικός για την ρύθμιση της έκφρασης των μιτοχονδριακών γονιδίων, του μεταβολισμού, της μιτοχονδριακής αναπνοής και του οξειδωτικού φορτίου. Επιπρόσθετα, αποδεικνύεται ότι το srl δρα συμπληρωματικά αλλά και αναπληρωματικά με τον cncC/Nrf2 για να καλύψει την γενετική του έλλειψη του στη διατήρηση της μιτόστασης και να βελτιώσει την μακροβιότητα των εντόμων. Τέλος, βρέθηκε ότι η μιτοχονδριακή βιογένεση δεν προτιμάται υπό συνθήκες καταστολής σύντηξης της ΕξΜΜ, αντιθέτως όμως ύστερα από καταστολή σύντηξης της ΕσΜΜ η ενεργοποίηση του srl προκαλεί περαιτέρω ενεργοποίηση του UPP, βελτίωση της ομοιοδυναμικής των μιτοχονδρίων και αύξηση της μακροβιότητας.Συνολικά, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία έχει σημαντικές επιπτώσεις στη φυσιολογία του οργανισμού. Παρά την ενεργοποίηση άμεσων κυτταρο-προστατευτικών μονοπατιών, το σύστημα δεν καταφέρνει να ισορροπήσει, γεγονός που οδηγεί σε σημαντική επιτάχυνση της γήρανσης. Η ενεργοποίηση των πρωτεοστατικών μηχανισμών είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ζωής και φαίνεται να μεσολαβείται από τους μεταγραφικούς παράγοντες cncC, foxo αλλά και από τον μεταγραφικό συμπαράγοντα Pgc-1α/srl. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η τοξικότητα που προκαλείται από τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία μπορεί εν μέρει να μειωθεί από μόρια με αντιγηραντικές ή αντιοξειδωτικές δράσεις ή μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα srl