Engineering artificial condensates in cells to study the role of RNA and molecular motors in controlling their formation

Biomolecular condensates, like nucleoli, PML bodies, stress granules, and P-bodies, are key elements of the subcellular organization, with liquid-liquid phase separation (LLPS) as a common model of formation. The biochemical composition and functions of the condensates begin to be deciphered, but how cells regulate their biophysical properties (size, number, morphology…) remains unclear. Reconstitution studies have been developed to circumvent the compositional complexity of endogenous condensates, but most of them are carried out in vitro because of a lack of tool to work in a cellular context. Here, we developed a method to build artificial condensates in living cells, combining both the control of in vitro reconstitution studies and the cellular environment. Their formation is based on multivalent proteins that dimerize and spontaneously phase separate over a threshold concentration. We showed that we were able to both prevent the formation of the condensates and dissolve them by adding a small chemical competitor. Moreover, the condensates can be enriched in a specific RNA-binding protein that recruits a unique synthetic exogenous RNA. By imaging the RNA molecules, we found that they were mainly recruited on the surface of condensates. Quantifying the recruitment allowed us to highlight a correlation between RNA surface density and the size and morphology of the condensates. A second part of the doctoral project concerned the subcellular localization of condensates when they undergo transport via interactions with motor proteins, a process that can notably localize the translation of mRNA contained in the condensates. To investigate the effect of molecular motors on phase-separated condensates, we developed a method to reconstitute in cells motor-functionalized condensates. We showed that the condensates displayed as from nucleation robust localization at the microtubules ends. Next, we successfully used this method to localize a target RNA species, heterelogously-expressed or endogenous. These proof-of-concept experiments open new possibilities for the investigation of the importance of mRNA subcellular localization.Les condensats biomoléculaires, comme les nucléoles, les corps PML, les granules de stress et les P-bodies, sont essentiels à l’organisation cellulaire. Un modèle commun de formation par séparation de phase liquide-liquide a récemment émergé. La composition biochimique et les fonctions des condensats commencent à être décrites, mais la façon dont les cellules contrôlent leurs propriétés biophysiques (taille, nombre, morphologie…) reste incertaine. Des études de reconstitution ont été développées pour contourner la composition complexe des condensats endogènes, mais la plupart de ces études ont été menées in vitro en raison du manque d’outil pour travailler dans le contexte cellulaire. Ici, nous avons développé une méthode pour construire en cellules des condensats artificiels, combinant le contrôle des études de reconstitution in vitro et le contexte cellulaire. Leur formation est basée sur la dimérisation de protéines multivalentes qui se séparent en deux phases au-dessus d’une concentration seuil. Nous avons montré la possibilité de prévenir la formation des condensats ou de les dissoudre par addition d’un compétiteur chimique de l’homodimérisation. En outre, les condensats peuvent être enrichis en une protéine de liaison à l’ARN qui recrute un unique ARN synthétique exogène. L’imagerie des molécules d’ARN a montré qu’elles étaient principalement recrutées à la surface des condensats. La quantification du recrutement nous a permis d’établir une corrélation entre la densité d’ARN à la surface et la taille et la morphologie des condensats. Dans un second temps, le projet doctoral s’est intéressé à la localisation intracellulaire des condensats quand ils sont transportés par des moteurs moléculaires, ce qui peut entre autres permettre la traduction localisée des ARNs des condensats. Pour examiner l’effet des moteurs sur les condensats, nous avons développé une méthode de fonctionnalisation des condensats artificiels en cellules avec des moteurs. Nous avons montré que les condensats étaient localisés dès la nucléation aux extrémités des microtubules. Ensuite, nous avons utilisé cette méthode pour localiser un ARN cible, soit exogène soit endogène. Ces résultats ouvrent de nouvelles possibilités pour étudier l’importance de la localisation intracellulaire des ARN