Avaliação in vitro da atividade de novos fármacos no desenvolvimento de Amyloodinium ocellatum

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, área científica - Sanidade AnimalO dinoflagelado Amyloodinium ocellatum é um ectoparasita protozoário que representa uma das maiores ameaças à produção de peixes marinhos. O ciclo de vida deste parasita consiste em três fases: dinosporos (fase flagelada, presente na coluna de água), trofontes (fase parasitária propriamente dita, presentes nas brânquias e pele dos hospedeiros) e tomontes (fase cística, após o desprendimento do trofonte do hospedeiro, presente no substrato). Apesar de o parasita A. ocellatum levar a uma taxa de mortalidade elevada, os tratamentos disponíveis não se mostraram eficazes na erradicação do parasita e, ainda, poderão apresentar-se como potencialmente perigosos para os organismos presentes no meio envolvente. Portanto, este estudo pretendeu determinar e avaliar o efeito de dezanove compostos endoperóxidos (doze 1,2,4,5-tetraoxanos e sete 1,2,4-trioxolanos) no desenvolvimento dos tomontes e dinosporos do A. ocellatum, in vitro, e, se possível, determinar as suas concentrações inibitórias médias (CI50). O processo de seleção dos compostos endoperóxidos ocorreu em duas fases. A primeira consistiu na avaliação do comportamento dos compostos em água salgada, por se tratar do meio onde se encontram tanto o hospedeiro, como o próprio parasita, tendo sido selecionados apenas os compostos que se mantiveram dissolvidos. Na segunda fase, os tomontes foram incubados com os compostos selecionados a uma concentração elevada (100 μM), sendo que apenas o 1,2,4,5-tetraoxano T7 e o 1,2,4-trioxolano O5 mostraram ter um efeito inibitório no desenvolvimento desta fase do parasita. Estes foram os únicos fármacos, entre os dezanove iniciais, que se encontravam na forma de sal e possuíam um grupo amina na sua estrutura molecular. Posteriormente, foram realizadas sucessivas incubações com os compostos selecionados, com concentrações sequencialmente mais baixas de modo a avaliar o efeito dos compostos T7 e O5 sobre o parasita. Em conclusão, o facto de os compostos se encontrarem em forma de sal e possuírem um grupo amina na sua estrutura molecular são características fulcrais para a sua dissolução em água salgada e inibição do A. ocellatum. Além disso, demonstrou-se que as duas ligações peróxido presentes na estrutura dos tetraoxanos são importantes para a estabilidade da molécula quando comparadas com a estrutura dos trioxolanos (uma ligação peróxido). Desta forma, obteve-se uma CI50 para o 1,2,4,5-tetraoxano T7 de 0,47 μM, não tendo sido possível o seu cálculo para o 1,2,4-trioxolano O5 devido à sua instabilidade.ABSTRACT - In vitro evaluation of the activity of new drugs on the development of Amyloodinium ocellatum - The dinoflagellate Amyloodinium ocellatum is a protozoan ectoparasite that represents one of the biggest threats to the production of marine fish in warm waters. The life cycle of this parasite consists of three phases: dinospores (flagellated phase, present in the water column), trophonts (parasitic phase, present on the hosts’ gills and skin), and tomonts (cystic phase, after the trophont detachment from the host, present in the substrate). Although the parasite A. ocellatum leads to high mortality rates, the treatments available are not effective in eradicating the parasite and could be potentially dangerous for the organisms present in the surrounding environment. Therefore, this study was intended to determine and evaluate the effect of the nineteen endoperoxides compounds (twelve 1,2,4,5-tetraoxanes and seven 1,2,4-trioxolanes) on the development of the tomonts and dinospores of A. ocellatum, in vitro, and, if possible, determine their inhibitory concentrations 50 (IC50). The selection process of the endoperoxides compounds took place in two phases. The first one consisted of the evaluation of the compounds’ behaviour in saltwater, because it is the environment of both the host and the parasite, and were selected the ones that remained dissolved. In the second phase, the tomonts were incubated with the selected compounds in a high concentration (100 μM), and only the 1,2,4,5-tetraoxane T7 and the 1,2,4-trioxolane O5 showed an inhibitory effect on the development of this parasite’s phase. These were the only drugs, among the initial nineteen, that were in salt form and had an amine group on their molecular structure. Subsequently, successive incubations with the selected compounds were carried out with sequentially lower concentrations to evaluate the effect of the compounds T7 and O5 on the parasite. In conclusion, the fact that the compounds are in salt form and have an amine group on their molecular structures are crucial features for their dissolution into saltwater and for the inhibition of A. ocellatum. Furthermore, it was demonstrated that the two peroxide bridges on the tetraoxanes’ structure are important for the molecule stability when compared to the trioxolanes’ structure (one peroxide bridge). Therefore, an IC50 of 0.47 μM was calculated for the 1,2,4,5-tetaoxane T7, although it was not possible to calculate the one for 1,2,4-trioxolane O5, due to its instability.N/