New approaches in salami manufacture with in-situ exopolysaccharide-forming starter cultures

Lactic acid bacteria have always been of great importance in the production of fermented sausages such as salami, as they contribute not only to microbial stability but also to acidity and flavor profiles of such products. Recently, exopolysaccharide (EPS)-forming starter cultures have attracted the interest of the food industry. EPS have water-binding, gelling, viscosity-increasing, as well as emulsifying properties and, due to these technofunctionalities, can contribute to the improvement of existing products as well as to new product developments. However, compared to hydrocolloids, which have similar functionalities, in-situ formed EPS do not have to be legally declared as ingredients on a package. Initial studies looking at the use of such cultures in spreadable, short-ripened raw sausages showed that the use of EPS-forming starter cultures can lead to a significant improvement in the spreadability of fat-reduced tea sausage and deeper acidified onion mettwurst (pH 5.1 instead of 5.6). However, no study to date has comprehensively addressed the use of in-situ EPS-forming starter cultures in sliceable, raw fermented sausage products such as salami, which differ significantly from spreadable raw sausage products in terms of product matrix. Since growth kinetics and acidification depend on the microorganism and the food matrix used, the growth and acidification behavior of selected homo- and heteropolysaccharide (HePS)-forming lactic acid bacteria as a function of different sugar concentrations (2.5 - 10 g/kg) was initially investigated. This was done to obtain an indication of the sugar concentration required in the raw sausage mass to achieve a target pH of 4.8-5.3 in the final product. Subsequently, the performance of two HePS-producing strains L. plantarum TMW 1.1478, and 1.25; and the two homopolysaccharide-producing lactic acid bacteria L. curvatus TMW 1.624 and L. sakei TMW 1.411 was investigated in a raw sausage model system (inoculation concentration 106 CFU/g), which, in addition to 25% pork back fat, 75% lean pork meat, also contained ascorbic acid (0.5 g/kg), nitrite curing salt (28 g/kg), and dextrose or sucrose (5 g/kg). Thereby, the strains to be used were specifically analyzed with regard to their suitability for EPS-formation under typical fermentation conditions prior to use in salami production. The latter was done qualitatively by confocal laser microscopy (CLSM), followed by semi-quantitative data interpretation using MATLAB. The results showed that all selected strains were able to produce EPS in the raw sausage model matrix. There, EPS were located on the surfaces of the proteins. Since presence of HePS, which are more complex in terms of chemical structure and are often charged, can lead to changes in the organization of protein matrices even when used in very small amounts due to e.g. electrostatic interactions, sausages were subsequently prepared with a HePS-forming (L. plantarum 1.1478) and a non-EPS-forming starter culture (L. sakei 1.2037; control). Moreover, the influence of different inoculation concentrations (107 and 109 CFU/g) on fermentation and associated HePS-formation, as well as their effect on quality parameters of the final products, were investigated. The selection of inoculation concentrations was governed by the hypothesis that higher inoculation concentrations could lead to a higher in-situ formed HePS amount in the raw sausage matrix and therefore to enhanced structural and thus organoleptic relevant effects. For this purpose, pork meat and fat-based raw sausages were prepared by adding and mixing spices, 0.5 g/kg Na-ascorbate, 5 g/kg sugar, the appropriate starter culture (107-109 CFU/g), and in the end 28 g/kg nitrite curing salt. Afterwards, the mass was filled, fermented (24 °C), smoked, and dried to a weight loss of 31%. In addition to pH and bacterial plate counts, the formed EPS were detected by CLSM and the influence of the formed HePS on the texture of the raw sausages was analyzed by texture profile analysis (at 16, 23, 27, and 31% weight loss) and further evaluated in a sensory evaluation for the attributes of consistency and taste. Although no significant differences were found with respect to the detected HePS and the inoculation concentration used, dependencies emerged with respect to product quality. Raw sausages produced with the HePS-producing starter culture L. plantarum 1.1478 were significantly (p < 0.05) softer than the corresponding control samples. This effect was more pronounced the higher the inoculation concentrations, which was also reflected in the sensory evaluation of samples. Semi-quantitative data interpretation of the CLSM images revealed that the HePS were predominantly formed during the first 72 h of fermentation at 24 °C, until the final pH of 4.95 ± 0.05 was reached. Although there was no clear preference in the sensory analysis performed, raw sausages with a firmer consistency are generally preferred in Germany. Accordingly, the use of an EPS-forming culture could, depending on the market, also have a negative impact on product properties. To gain a better understanding of the observed results and the influence of process conditions on in-situ HePS-formation and its effects on the quality of sliceable raw fermented sausages, the temperatures of the fermentation phase were varied in a further study. In addition to the 24 °C already examined, an additional incubation temperature of 16 °C, commonly used in the production of raw sausages, and a low temperature incubation of 10 °C were chosen, since increased stress conditions are often associated with increased EPS formation. Raw sausages inoculated with L. plantarum 1.1478 or L. sakei 1.2037 (108 CFU/mL) were fermented at 10, 16, or 24 °C within the first 7 days and then dried under the same conditions (14 °C, controlled relative humidity) until a weight loss of 31% was reached. Microbial growth, pH, and weight loss development were monitored, EPS detected with CLSM, and products further characterized by texture profile analysis and a sensory test. Here, texture profile analysis was performed not only from the final product, but also after 21% and 26% weight loss to better understand the influence of the in-situ produced HePS. Differences were found depending on the starter culture used as well as on the fermentation temperature. Products manufactured with the non-EPS-forming strain L. sakei 1.2037 reached the target weight loss of 31% slightly faster than products manufactured with the HePS-former L. plantarum 1.1478. In both products, the final weight loss of 31% was reached faster at an initial fermentation temperature of 24 °C than at the lower fermentation temperatures. A correlation of temperatures with the amount of HePS formed could not be conclusively proven using semi-quantitative data analysis of CLSM images because matrix effects complicated the determination. However, texture profile analysis results showed a difference between products fermented at 24 °C and those fermented at cooler temperatures. In addition, significant (p < 0.05) differences were again observed between products with (softer) and without (harder) HePS-forming starter cultures at weight losses at or above 21%. These results were confirmed in the final sensory evaluation of the products (pH 4.89 - 5.01; 31% weight loss). In summary, the results of this thesis show that the use of a HePS-forming starter culture in sliceable raw fermented sausage can induce specific structural and textural changes. HePS-formation and associated quality attributes may be modulated via the inoculation concentration and control of processing parameters such as fermentation temperature. The texture softening observed in the present work, can be positively or negatively associated with the product depending on the target country and market. Taken together, results of this work underline the importance of a suitable starter culture selection for the production of fermented sausages. &#8195;Milchsäurebakterien sind von großer Bedeutung bei der Herstellung von fermentierten Wurstwaren wie z. B. Rohwurst, da sie nicht nur zur mikrobiellen Sicherheit, sondern auch zur Bildung charakteristischer Säure- und Geschmacksprofile derartiger Produkte beitragen. In jüngster Zeit haben Exopolysaccharid (EPS)-bildende Starterkulturen das Interesse der Lebensmittelindustrie geweckt. EPS haben wasserbindende, gelierende, viskositätserhöhende, sowie emulgierende Eigenschaften und können aufgrund dieser Technofunktionalitäten sowohl zur Verbesserung bestehender Produkte als auch zu neuen Produktentwicklungen beitragen. Im Vergleich zu Hydrokolloiden, die ähnliche Funktionalitäten aufweisen, müssen in-situ gebildete EPS jedoch nicht auf der Verpackung als Inhaltsstoffe deklariert werden. Fermentierte Produkte werden von Verbrauchern als natürlich, sicher und qualitativ hochwertig wahrgenommen. Erste Studien, die sich mit dem Einsatz derartiger Kulturen in streichfähigen, kurz gereiften Rohwürsten beschäftigt haben, zeigten, dass der Einsatz von EPS-bildenden Starterkulturen zu einer signifikanten Verbesserung der Streichfähigkeit von fettreduzierter Teewurst und hochgesäuerter Zwiebelmettwurst (pH 5,1 statt 5,6) führen kann. Bislang beschäftigte sich allerdings noch keine Studie umfassend mit dem Einsatz von in-situ EPS-bildenden Starterkulturen in schnittfesten Rohwurstprodukten. Schnittfeste Rohwürste unterscheiden sich grundsätzlich von streichfähigen Rohwurstprodukten. Strukturell bestehen sie aus einem kontinuierlichen Proteinnetzwerk in das Fettpartikel eingelagert sind, Da die Wachstumskinetik und Säurebildung der eingesetzten Mikroorganismen von der Struktur und Zusammensetzung der Lebensmittelmatrix abhängt, wurde zu Beginn der Dissertation das Wachstums- und Säuerungsverhalten von selektierten, Homo- und Heteropolysaccharid (HePS)-bildenden Milchsäurebakterien in Abhängigkeit verschiedener Zuckerkonzentrationen (2,5 10,0 g/kg) untersucht. Das Ziel war, Selektionskriterien für die Auswahl geeigneter Zuckerkonzentrationen in der Rohwurstmasse zu erarbeiten, so dass pH-Werte von 4,8-5,3 im Endprodukt erzielt werden können. Darüber hinaus wurden die beiden HePS-bildenden Stämmen L. plantarum TMW 1.1478, und 1.25; sowie die beiden Homopolysaccharid-bildenden Milchsäurebakterien L. curvatus TMW 1.624 und L. sakei TMW 1.411 in einem Rohwurstmodellsystem eingesetzt (Ausgangskonzentration jeweils 106 KBE/g), das neben 25% Schweinerückenspeck und 75% magerem Schweinefleisch, auch Ascorbinsäure (0,5 g/kg), Nitrit Pökelsalz (NPS; 28 g/kg), sowie Dextrose oder Saccharose (5 g/kg basierend auf den Untersuchungen in MRS Medium) enthielt. So konnten die zu verwendeten Stämme vor dem Einsatz in der Salamiproduktion hinsichtlich ihrer Eignung zur EPS-Bildung unter typischen Fermentationsbedingungen bewertet werden. Die EPS Bildung wurde qualitativ mittels konfokaler Lasermikroskopie (CLSM) charakterisiert, gefolgt von einer semi-quantitativen Dateninterpretation mittels MATLAB. Die Ergebnisse belegten, dass alle ausgewählten Stämme grundsätzlich in der Lage waren, EPS in der Rohwurstmodellmatrix zu produzieren, wobei sich die EPS an den Oberflächen der Proteinpartikel akkumulierten. Da die in ihrer Struktur komplexeren und oftmals geladenen HePS aufgrund von beispielsweise elektrostatischen Wechselwirkungen bereits in sehr kleinen Mengen zu Veränderungen in der Proteinmatrix führen können, wurden anschließend schnittfeste Rohwürste mit einer HePS-bildenden (L. plantarum 1.1478) und einer nicht EPS-bildenden Starterkultur (L. sakei 1.2037; Kontrolle) hergestellt und der Einfluss verschiedener Inokulationskonzentrationen (107 und 109 KbE/g) auf die Fermentation und die assoziierte HePS-Bildung, sowie deren Auswirkung auf Qualitätsparameter der Endprodukte bestimmt. Der Auswahl der Inokulationskonzentrationen ging die Hypothese voraus, dass höhere Inokulationskonzentrationen zu einer höheren in-situ gebildeten HePS-Menge in der Rohwurstmatrix und somit zu verstärkten strukturellen und somit sensorisch-relevanten Effekten führen. Dazu wurden Rohwurstmassen unter Zugabe von Gewürzen, 0,5 g/Kg Na-Ascorbat, 5 g/Kg Zucker, der zu untersuchenden Starterkultur (107-109 KbE/g) und 28 g/Kg NPS hergestellt, die Massen in Hüllen gefüllt, fermentiert (24 °C), geräuchert, und bis zu einem Gewichtsverlust von 31% getrocknet. Neben pH und anaeroben Keimzahlen, wurden die gebildeten EPS mit CLSM detektiert und der Einfluss der gebildeten HePS auf die Textur der Rohwürste mittels Texturprofilanalyse (bei 16, 23, 27 und 31% Gewichtsverlust) analysiert sowie in einer sensorischen Evaluierung auf die Attribute Konsistenz und Geschmack hin bewertet. Obwohl keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die detektierten HePS und die verwendete Inokulationskonzentration festgestellt werden konnte, ergaben sich Abhängigkeiten hinsichtlich der Produktqualität. Rohwürste, welche mit der HePS-produzierenden Starterkultur L. plantarum 1.1478 hergestellt wurden, waren signifikant (p < 0,05) weicher als die entsprechenden Kontrollproben. Dieser Effekt war im Falle höherer Inokulationskonzentrationen noch stärker ausgeprägt, was sich auch in der sensorischen Bewertung der Produktproben widerspiegelte. Die semiquantitative Dateninterpretation der CLSM-Bilder ergab, dass die HePS überwiegend während der ersten 72 h der Fermentation bei 24 °C, bis zum Erreichen des End-pH-Wertes von 4,95 ± 0,05 gebildet wurden. Auch wenn es in der durchgeführten Sensorik keine eindeutige Präferenz gab, werden in Deutschland allgemein eher Rohwürste mit fester Konsistenz bevorzugt. Der Einsatz einer EPS-bildeten Kultur könnte sich demnach, je nach Markt, auch negativ auf die Produkteigenschaften auswirken. Um ein besseres Verständnis hinsichtlich des Einflusses von Prozessbedingungen auf die in-situ HePS-Bildung und deren Auswirkungen auf die Qualität von schnittfester Rohwurst zu erhalten, wurden die Temperaturen der Fermentationsphase variiert. Neben der bereits verwendeten Fermentationstemperatur von 24 °C wurde eine in der Produktion von Rohwürsten übliche Inkubationstemperatur von 16 °C, und mit 10 °C eine niedrige Temperatur gewählt, da erhöhte Stressbedingungen zu einer gesteigerten EPS-Bildung führen könnten. Die mit L. plantarum 1.1478 oder L. sakei 1.2037 beimpften (108 KbE/mL) Rohwürste wurden innerhalb der ersten 7 Tage bei 10, 16 oder 24 °C fermentiert und anschließend unter gleichen Bedingungen bis zum Erreichen eines Gewichtsverlusts von 31% getrocknet. Das mikrobielle Wachstum, der pH-Wert und der Gewichtsverlust wurden über den Studienzeitraum von 7 Tagen bestimmt, EPS mit CLSM detektiert und die Produkte mittels Texturprofilanalyse und einem sensorischen Test charakterisiert. Eine Texturprofilanalyse wurde nicht nur am Endprodukt, sondern auch in Proben, die einen Gewichtsverlust von 21% und 26% hatten, durchgeführt um die Kinetik der in-situ HePS Wirkung zu verstehen. Es konnten sowohl Unterschiede je nach eingesetzter Starterkultur als auch Fermentationstemperatur festgestellt werden. Produkte, die mit dem nicht-EPS bildenden Stamm L. sakei 1.2037 hergestellt wurden, erreichten den angestrebten Gewichtsverlust von 31% schneller, als die Produkte, die mit dem HePS-Bildner L. plantarum 1.1478 produziert wurden. In beiden Produkten wurde ein Gewichtsverlust von 31% bei einer Fermentationstemperatur von 24 °C schneller erreicht, als bei den niedrigeren Temperaturen. Eine Korrelation zwischen Temperaturen und HePS-Bildungsmenge konnte mittels der semiquantitativen Datenanalyse der CLSM Bilder jedoch nicht herbeigeführt werden, da Bestimmungen der Menge mit großen Schwankungen verbunden waren. Allerdings zeigten die Ergebnisse der Texturprofilanalyse tendenziell einen Unterschied zwischen Produkten die bei 24 °C oder bei geringeren Temperaturen fermentiert wurden. Darüber hinaus konnten signifikante (p < 0.05) Unterschiede zwischen Produkten mit und ohne HePS-bildender Starterkultur bereits bei 21% Gewichtsverlust festgestellt werden. Die Ergebnisse konnten in der abschließenden sensorischen Evaluierung der schnittfesten Rohwürste (pH 4.89 5.01; 31% Gewichtsverlust) bestätigt werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Dissertation, dass der Einsatz einer HePS-bildenden Starterkultur in schnittfester Rohwurst spezifische Struktur- bzw. Texturveränderungen hervorrufen kann. Hierbei ist es möglich, über die Inokulationsmenge und die Steuerung der Fermentationstemperatur, Einfluss auf die HePS-Bildung und assoziierte Qualitätsattribute zu nehmen. Die in der vorliegenden Arbeit beobachteten texturellen Veränderungen könnten abhängig von der Präferenz der Verbraucher positiv oder negativ mit dem Produkt assoziiert werden. Die Ergebnisse der Arbeit unterstreichen damit die große Bedeutung einer geeigneter Starterkulturselektionen für die Herstellung fermentierter Wurstwaren