Digital PCR development

Mikrotechnologické a nanotechnologické metody se v posledních letech ukázaly jako účinný nástroj pro analýzu deoxyribonukleové kyseliny (DNA). Různé techniky vyvinuté k amplifikaci nukleových kyselin (NK) byli publikovány v posledním desetiletí, včetně mikrofluidních systémů. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je v molekulární biologii široce používána k amplifikaci cílové NK in vitro. Počet skupin pracujících s PCR po celém světě je obrovský vzhledem k důležitému sociálnímu a ekonomickému dopadu této techniky, například v oblasti lékařské diagnostiky, kriminalistiky, zpracování potravin nebo environmentálních studií. V současné době pandemie koronavirového onemocnění 2019 se prokázala důležitost vývoje přístupnějších technologií pro diagnostiku virových onemocnění. Disertační práce popisuje vývoj dvou verzí platforem PCR pro detekci NK, kapkovou kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) a digitální PCR (dPCR). Klíčové komponenty obou platforem byly vyrobeny pomocí mikrotechnologických postupů pro úpravu povrchů a litografickou výrobu umožňující vývoj hydrofobních krycích skel nebo křemíkových mikročipů. Výsledky práce demonstrují návrh, sestavení a testování včetně optimalizace obou platforem. Technologie PCR je tvořena softwarovou částí, ovládanou programem LabView a hardwarovou častí sestávající ze systému řízení teploty a zobrazovacího systém florescence. Kapková qPCR byla prováděna v 0.3 µL kapky směsi obsahující cílový gen napipetovaný v objemu 2 µL kapky minerálního oleje. Kapky byly pipetovány na hydrofobní krycí sklo, které bylo umístěno na termoelektrický chladič (TEC) pod fluorescenční mikroskop, aby se provedlo teplotní cyklování. Změny fluorescence během cyklů byly zachyceny fotonásobičem a sledovány osciloskopem. Výsledky testování popisují také schopnost multiplexování vyvinuté techniky. V práci je představená amplifikace tří syntetických genů s využitím interkalačního fluorescenčního barviva pro simultánní detekci a kvantifikaci na základě jednoho fluorescenčního kanálu. Kapková technologie qPCR byla zásadní platformou pro další vývoj platformy dPCR. Platforma dPCR používá křemíkový mikročip s disperzí vzorku do mikrojamek o celkovém počtu 26 448, každá s průměrem 50 µm a objemem 59 pL. Mikročip naplněn vzorkem byl pokryt minerálním olejem a krycím sklem modifikovaným polydimethylsiloxanem a Parylenem C. Systém ohřevu/chlazení teplotního cyklování s TEC byl podobný jako u kapkové platformy qPCR. Fluorescenční zobrazovací systém používal k zachycení fluorescenčních obrazů polovodičovou kameru na bázi CMOS. Vyvinutá dPCR byla testována pro aplikace ve výzkumu humánní medicíny. Testovací vzorky DNA byly část syntetického genu viru, izolovaná genomická DNA viru a izolovaná genomická DNA ženy. Disertační práce popisuje vývoj systému dPCR, který je součástí nové techniky dPCR, která je cenově dostupnější a snadno použitelná s jednoduchým dávkováním vzorků, což jsou nejčastější problémy, proč si zatím mezi laboratořemi nenašla velkou popularitu. dPCR mikročip na bázi křemíku zlepšil výkon systému díky velkému počtu mikrojamek. Využití technologie dPCR vyniká ve vysoké citlivosti, v nízkém poměru signálu k šumu, dosahované přesnosti, v nízkém detekčním limitu a schopnosti multiplexování