Production of Virus-Like Particles in HEK 293 cells and functionalization with SARS-CoV-2

Els vaccins són l'invent més rendible de la història de la humanitat quant a vides salvades i la seva rellevància en la societat s'ha fet evident durant la recent pandèmia de COVID-19. En aquest sentit, les Virus-Like Particles (VLPs) constitueixen una prometedora aproximació per al desenvolupament de nous candidats vacunals. Aquest treball es centra en la producció de VLPs mitjançant l'expressió recombinant de la poliproteïna Gag del VIH-1 i la seva modificació amb l'objectiu de presentar epítops de patògens d'interès. El treball es pot dividir en tres apartats principals. El primer, format pels capítols u i dos, estudia la funcionalització de les VLPs de Gag amb la proteïna Spike (S) del SARS-CoV-2. El segon, format pels capítols tres, quatre, cinc i sis, es focalitza en la generació, caracterització i millora de la producció de diferents línies cel·lulars d'expressió gènica estable (SGE) per a la producció de VLPs de Gag. El tercer, format pel capítol set, fusiona els coneixements adquirits en els apartats anteriors per produir VLPs funcionalitzades amb la proteïna S a escala de bioreactor. En el primer capítol, es presenta una metodologia que permet la generació de VLPs de Gag funcionalitzades amb la proteïna S (S-VLPs) mitjançant la co-expressió de les proteïnes S i Gag. S'assoleix la funcionalització de les VLPs, la seva producció és optimitzada mitjançant disseny d'experiments i es realitza un cultiu en bioreactor seguit d'un procés de purificació amb potencial per a ésser traslladat a escala industrial. Al capítol dos, es proposen diverses variants de S-VLPs que presenten diferents mutacions de proteïna S. La influència de les mutacions en l'expressió i la qualitat de les VLPs és estudiada. Posteriorment, es realitzen assajos per a avaluar el reconeixement de les VLPs per part de sèrum de persones recuperant-se de la COVID-19 per a seleccionar la millor variant en funció del seu potencial immunogènic. Al capítol tres, es genera una línia cel·lular estable per a la producció de VLPs de Gag, mitjançant integració aleatòria. La selecció del clon 10H9 és basada en els seus paràmetres de creixement, la producció de VLPs i l'estabilitat de l'expressió. Al capítol quatre, es genera una línia cel·lular estable que expressa VLPs de Gag de manera constitutiva, mitjançant la integració dirigida al genomic safe harbor AAVS1 mitjançant CRISPR/Cas9. El clon seleccionat, anomenat 13++, millora significativament els nivells de producció de la línia cel·lular 10H9. A més, l'èxit obtingut emprant aquesta tècnica, la postula com una metodologia interessant per a la producció de noves línies cel·lulars. Al capítol cinc, es genera mitjançant transducció lentiviral una línia cel·lular competent per intercanvi de cassets mediat per recombinasa (RMCE) que expressa de forma estable VLPs de Gag. Els clons s'examinen en termes de cinètica de creixement, producció de VLPs, estabilitat i capacitat de dur a terme intercanvi de cassets per RMCE. El clon seleccionat, anomenat SH5, pot ser emprat per a generar fàcilment línies cel·lulars estables d'alta producció per a l'expressió de pràcticament qualsevol gen d'interès. En el capítol sis, es comparen els nivells de producció i la qualitat de les VLPs de les línies cel·lulars 10H9, 13++ i SH5, tot comparant-les amb una producció per expressió gènica transitòria (TGE), mentre que s'estudien els medis de cultiu utilitzats i la durada del bioprocés. El cultiu de la línia cel·lular 13++ en medi HyCell durant 10 dies millora en 2,7 vegades els nivells de producció de VLPs de la TGE. Finalment, al capítol set, s'estudia la producció de S-VLPs mitjançant la transfecció transitòria de la línia cel·lular 13++ en bioreactor d'un litre. Els resultats s'avaluen i es discuteixen per definir els passos a seguir en futurs processos per a la generació de VLPs pseudotipades.Las vacunas son el invento más rentable de la historia de la humanidad en cuanto a vidas salvadas y su relevancia en la sociedad se ha hecho evidente durante la reciente pandemia de COVID-19. En este sentido, las Virus-Like Particles (VLPs) constituyen una prometedora aproximación para el desarrollo de nuevos candidatos vacunales. Este trabajo se centra en la producción de VLPs mediante la expresión de la poliproteína Gag del VIH-1 y su modificación para presentar epítopos de patógenos de interés. El trabajo puede dividirse en tres apartados principales. El primero, formado por los capítulos uno y dos, estudia la funcionalización de las VLPs de Gag con la proteína Spike (S) del SARS-CoV-2. El segundo, formado por los capítulos tres, cuatro, cinco y seis, se focaliza en la generación, caracterización y mejora de la producción de diferentes líneas celulares de expresión génica estable (SGE) para la producción de VLPs de Gag. El tercero, formado por el capítulo siete, fusiona los conocimientos adquiridos en los apartados anteriores para producir VLPs funcionalizadas con la proteína S a nivel de biorreactor. En el primer capítulo, se presenta una metodología que permite la generación de VLPs de Gag funcionalizadas con la proteína S (S-VLPs) mediante la co-expresión de las proteínas S y Gag. Se alcanza la funcionalización de las VLPs, su producción es optimizada mediante diseño de experimentos y se realiza un cultivo en biorreactor seguido de un proceso de purificación con potencial para su traslado a escala industrial. En el capítulo dos, se proponen diversas variantes de S-VLPs que presentan diferentes mutaciones de proteína S. La influencia de las mutaciones en la expresión y calidad de las VLPs es estudiada. Posteriormente, se realizan ensayos para evaluar el reconocimiento de las VLPs por parte de suero de personas recuperándose de la COVID-19 para seleccionar la mejor variante en función de su potencial inmunogénico. En el capítulo tres, se genera una línea celular estable para la producción de VLPs de Gag, mediante integración aleatoria. La selección del clon 10H9 está basada en sus parámetros de crecimiento, la producción de VLPs y la estabilidad de la expresión. En el capítulo cuatro, se genera una línea celular estable que expresa VLPs de Gag de forma constitutiva, mediante la integración dirigida al genomic safe harbor AAVS1 mediante CRISPR/Cas9. El clon seleccionado, 13++, mejora significativamente los niveles de producción de la línea celular 10H9. Además, el éxito obtenido utilizando esta técnica, la postula como una metodología interesante para la producción de nuevas líneas celulares. En el capítulo cinco, se genera mediante transducción lentiviral una línea celular competente por intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) que expresa de forma estable VLPs de Gag. Los clones se examinan en términos de cinética de crecimiento, producción de VLPs, estabilidad y capacidad de llevar a cabo RMCE. El clon seleccionado, SH5, puede utilizarse para generar fácilmente líneas celulares estables de alta producción para la expresión de prácticamente cualquier gen de interés. En el capítulo seis, se comparan los niveles de producción y la calidad de las VLPs de las líneas celulares 10H9, 13++ y SH5, comparándolas con una producción por expresión génica transitoria (TGE), mientras que se estudian los medios de cultivo utilizados y la duración del bioproceso. El cultivo de la línea celular 13++ en medio HyCell durante 10 días mejora en 2,7 veces los niveles de producción de VLPs de la TGE. Por último, en el capítulo siete, se estudia la producción de S-VLPs mediante TGE de la línea celular 13++ en biorreactor de un litro. Los resultados se evalúan y se discuten para definir los pasos a seguir en futuros procesos para la generación de VLPs pseudotipadas.Vaccines are the most cost-effective life-saving invention of the human history and their relevance in society had become evident during the recent COVID-19 pandemic. Virus-like particles (VLPs) are a promising approach for the development of new vaccine candidates. This work is focused on the production of VLPs by the recombinant expression of the HIV-1 Gag polyprotein, and their modification to present epitopes from pathogens of interest. The work can be divided in three main sections. The first one, comprising chapters one and two, studies the functionalization of Gag VLPs with the SARS-CoV-2 Spike (S) protein. The second one, comprising chapters three, four, five and six, focuses on the generation, characterization and production enhancement of different stable gene expression (SGE) cell lines for the production of Gag-VLPs. Finally, the third one, comprising chapter seven, merges the knowledge acquired in the previous sections to produce S-functionalized VLPs at bioreactor scale. In chapter one, the methodology for the generation of Gag-VLPs incorporating the S protein (S-VLPs) by the transient co-expression of S and Gag proteins is presented. The functionalization of the VLPs is achieved, their production is enhanced using design of experiments (DoE), and a bioprocess consisting of a bioreactor followed by a scalable downstream purification process is performed. In chapter two, several S-VLP variants harboring different S protein mutations are proposed. The influence of the mutations is studied in terms of VLP expression and quality. After that, COVID-19 convalescent human sera recognition assays are performed to select the best proposed variant based on its immunogenic potential. In chapter three, a stable cell line for the production of Gag-VLPs is generated by means of illegitimate random integration. The selection of the 10H9 clone is based on growth kinetics, VLP production and expression stability. In chapter four, a SGE cell line constitutively expressing Gag-VLPs is generated by locus-specific integration at the AAVS1 genomic safe harbor using CRISPR/Cas9. The selected clone, named 13++, greatly improves the production levels of the 10H9 cell line. Moreover the success of the used integration approach postulates it as an interesting methodology for the production of new cell lines. In chapter five, a Recombinase-Mediated Cassette Exchange (RMCE)-competent cell line stably expressing Gag-VLPs is generated by lentiviral transduction. The clones are screened in terms of growth kinetics, VLP production, stability, and ability to perform RMCE targeting. The selected clone, named SH5, can be used to easily generate high producer stable cell lines for the expression of virtually any gene of interest. In chapter six, the VLP production and quality of the 10H9, 13++ and SH5 cell lines are compared with transient gene expression (TGE), while the culture media used and the length of the bioprocess is studied. 13++ cell line cultured in HyCell media and harvested at day 10 improves by 2.7-fold the VLP production levels of TGE. Finally, in chapter seven, the production of S-VLPs by 13++ cell line transfection at 1 liter bioreactor is studied. The results are evaluated and discussed to define the steps to be followed in future processes for the generation of pseudotyped VLPs