Characterization of plant cellular responses upon pathogen-induced RNA silencing suppression

que regular la producción de distintos efectores para explotar completamente al huésped en su propio beneficio. El silenciamiento génico mediado por ARN es un mecanismo de defensa antiviral y, como tal, está sometido a una carrera armamentística entre plantas y patógenos. Patógenos como virus, bacterias y oomicetos, producen efectores que actúan como supresores de silenciamiento (SSs). Los SSs no solo afectan al sistema de defensa de la planta, también afectan otros procesos endógenos liberando tránscritos de la regulación por ARNs de pequeño tamaño (sRNA). En ausencia de sRNAs funcionales, la liberación de sus tránscritos diana podría facilitar la reprogramación de la defensa y desarrollo del huésped. Esta tesis abarca el estudio de respuestas específicas de tipo celular en Arabidopsis thaliana desencadenadas por SSs, y el papel de estas respuestas en la "carrera armamentística" entre planta y patógeno. En primer lugar, se establecieron los tipos celulares en los que se detectó una supresión del silenciamiento tras la infección con patógenos. En infecciones con patógenos no relacionados, como Plump Pox Virus (PPV) y Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 (Pto DC3000), la supresión del silenciamiento se vio afectada en células de mesófilo. Además, se vio que PPV coloniza y afecta la supresión del silenciamiento en vasculatura. Por otra parte, se estudió la reprogramación transcripcional específica de tipo celular como resultado de la supresión de silenciamiento desencadenada por patógenos. Para ello, se analizaron los cambios en el transcriptoma de Characterization of plant cellular responses upon pathogen-induced RNA silencing suppression 16 plantas que expresan de manera inducible el SS Hc-Pro de Turnip Mosaic Virus (TuMV) en mesófilo y vasculatura y de plantas que expresan de manera inducible el SS HopT1-1 de Pto DC3000 en mesófilo. Los cambios en el transcriptoma encontrados en células de mesófilo que expresan Hc-Pro fueron menores que los cambios observados cuando se expresa HopT1-1, que además estaban incluidos en estos últimos. Este resultado sugiere que el impacto en el silenciamiento del huésped de HopT1-1 es mayor que el de Hc-Pro. Entre los procesos activados se encontraron: inmunidad, actividad del proteosoma y estrés del retículo endoplasmático. Entre los procesos inhibidos, se encontraron: fotosíntesis, organización de cloroplastos y plastidios y traducción proteica. Entre los genes de inmunidad cuyos niveles se vieron aumentados, hay varios involucrados en inmunidad activada por constituyentes de patógenos (PTI) e inmunidad activada por efectores (ETI). Estos resultados indican que la presencia de SSs en células de mesófilo desencadena contra-contramedidas en la planta. En células de vasculatura, la inducción de Hc-Pro resultó en menor cambio transcripcional. Estos resultados indican que la inducción de Hc-Pro lleva a una reprogramación específica de tipo celular y que las células de vasculatura apenas responden a la presencia de SSs. Finalmente, se estudió la contribución a la defensa de la planta de los diferentes eventos desencadenados por la reprogramación mediada por SSs. Nuestros resultados indican que la inducción de HopT1-1 en células de mesófilo desencadena mecanismos de contra-contra-defensa, combatiendo las infecciones por virus y bacterias. Por tanto, la supresión de silenciamiento de ARN desencadenada por patógenos activa en la planta un nuevo nivel de defensa, en la que las dianas de sRNA de la planta podrían desempeñar un papel importante.Plants have developed molecular mechanisms to defend themselves from pathogens. On the other hand, pathogens have evolved counter-measures (i.e. effector proteins) to elude plant defence programs, and thus ensues an ongoing ''arms race'' between plant and pathogen that contributes to their evolution. That tug of war depends on a delicate and highly dynamic balance between plants and pathogens. Plants must tightly regulate the timing and intensity of their immune responses to avoid undesired effects from defence-development trade-off. On the other hand, pathogens have to modulate host cell pathways by precisely controlling the production of different effectors for fully exploiting their host on their own benefit. RNA-mediated gene silencing is an antiviral defence system and as such is the subject of an ''arms race'' between plants and pathogens. Pathogens such as viruses, bacteria and oomycetes, produce effectors working as silencing suppressors (SSs). Pathogen-produced SSs disrupt not only the plant defence system, but they also perturb other endogenous processes by releasing host transcripts from small RNA (sRNA) regulation. In the absence of functional sRNAs, the concomitant release of their target transcripts may facilitate the reprogramming of host defence and development. This thesis comprises the study of the cell-type specific responses to pathogen-derived SSs and their role in the ''arms race'' between host and pathogens around RNA silencing. The work was performed in Arabidopsis thaliana. First, I established the cell-types targeted by pathogens for RNA silencing suppression in the course of infections. Unrelated pathogens, such as Plump Pox Virus (PPV) and Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto DC3000) bacteria, targeted leaf mesophyll cells for plant RNA silencing suppression. In addition, it was found that PPV colonized and impaired silencing suppression in vascular cell types. On the other hand, cell-type specific transcriptional reprogramming as result of pathogen-triggered silencing suppression was studied. For that aim, the transcriptome changes from plants conditionally expressing the SS Hc-Pro from Characterization of plant cellular responses upon pathogen-induced RNA silencing suppression 14 Turnip Mosaic Virus (TuMV) in mesophyll and vascular cells and from plants conditionally expressing the SS HopT1-1 from Pto DC3000 in mesophyll cells were analysed. Transcriptome changes found in Hc-Pro expressing mesophyll cells were fewer than those found when HopT1-1 was induced. Furthermore, the latter cover most of the transcriptome changes found when Hc-Pro was induced. That result suggested that HopT1-1 impact on host silencing was larger than that of Hc-Pro. Immunity, Proteasome activity and Endoplasmic Reticulum (ER) stress were found as the processes that were up-regulated, while photosynthesis, chloroplast and plastid organization and protein translation related processes were the most representative down-regulated processes. Among the up-regulated immunity related genes, there were elements involved both in pathogen triggered immunity (PTI) and effector triggered immunity (ETI). These results indicate that the presence of SSs in plant mesophyll cells triggers host defence counter-counter measures. In vascular cells, Hc-Pro induction resulted in minor transcriptional changes in both cell types. These results indicate that Hc-pro induction led to cell type specific reprogramming and that vascular cell types were more refractory to the presence of that SS than mesophyll cells. Finally, the contribution to plant defence from the different events triggered by SS-mediated reprogramming was assayed by infecting plants conditionally expressing the different SSs with TuMV and Pto DC3000. Our results indicate that HopT1-1 induction in mesophyll cells results in counter-counter defence mechanisms that override both viral and bacterial infections. Thus, pathogen-triggered host RNA silencing suppression enables a new layer of plant defence, in which host sRNA targets may play an important role, comprising counter-counter defence mechanisms and thus, ensues an "arms race" between host and pathogen around RNA silencing