Brain, lung and plasma alterations induced by diesel exhaust particle exposure in the context of ischemic stroke

La contaminació de l'aire a les ciutats està formada per material particulat (PM), gasos, compostos orgànics i metalls. No obstant, es considera que la fracció de material particulat provinent de la combustió artificial de combustibles fòssils, anomenade partícules d'escapament de dièsel (DEP), és la més perjudicial per a la salut humana: com més petita és la partícula més capacitat de penetració té i més mal pot infligir. Dades recents indiquen que la mortalitat i la morbiditat global de les malalties cardiovasculars estan fortament influenciades per les accions perjudicials de la PM. De les malalties cardiovasculars, l'ictus és la segona causa de mort a nivell mundial sent el 85% causats per l'oclusió de vasos sanguinis que irriguen el cervell. Actualment es creu que la PM contribueix a la patologia de l'ictus isquèmic a través de mecanismes d'inflamació, pro-trombosi i/o impedint processos de recuperació. L'objectiu d'aquesta tesi és investigar la possible interacció de les DEP amb els mecanismes fisiopatològics de la isquèmia cerebral abans i durant la fase aguda de la malaltia emprant models experimentals que inclouen un model murí d'isquèmia cerebral in vivo, cultius de cèl·lules mare neurals in vitro (NSC) i un assaig turbidimètric ex vivo de formació de coàguls i lisi induïda per tPA amb mostres plasmàtiques humanes i murines. Les metal·loproteïnases de matriu (MMPs) són enzims clau relacionats amb les lesions i la inflamació agude per ictus, però també són essencials en la fase de reparació. Als pulmons de ratolins sans exposats a DEP durant 3 dies (exposició aguda) o 3 setmanes (crònica), els nivells de MMPs no es van alterar. No obstant, al cervell van disminuir després de l'exposició aguda i van augmentar després de la crònica. A més, l'exposició crònica va reduir les neurones corticals, mentre que les dues exposicions van disminuir les NSC a la via migratòria rostral coincidint amb resultats in vitro que van mostrar menor viabilitat de les NSC en presència de DEP. Després de l'exposició a DEP (aguda/crònica), els ratolins van ser sotmesos a una oclusió permanent de l'artèria cerebral mitjana (isquèmia). Només als pulmons del grup exposat crònicament, les MMPs es van veure alterades juntament amb una reducció dels macròfags alveolars i un augment dels macròfags intersticials i monòcits. Tot i això, la lesió cerebral produïda per la isquèmia no es va veure agreujada per la preexposició a DEP ni tampoc es van alterar els nivells de MMPs ni el recompte de diferents cèl·lules del sistema nerviós central (SNC). Els possibles efectes sistèmics de l'exposició a DEP es van estudiar analitzant les característiques trombogèniques/trombolítiques del plasma mitjançant turbidimetria. Al plasma de ratolí i humà es van produir canvis pro-trombogènics després de la isquèmia, que es van exacerbar en presència de DEP. La trombòlisi es va alentir en el grup crònic-isquèmic que va retornar als paràmetres basals en presència de DEP i es va veure accelerada als plasmes de persones residents en zones altament contaminades. Sintetitzant, les DEP poden regular l'expressió de proteases cerebrals en animals sans, així com reduir les poblacions de progenitors neurals i neurones madures, comprometent el balanç fisiològic del SNC. Tot i això, no s'ha observat una exacerbació de la lesió isquèmica cerebral després de l'exposició a DEP, encara que cal dilucidar la seva influència en la fase de reparació. A nivell sistèmic, l'exposició a DEP sí que va influir en el reclutament de leucòcits als pulmons després de la isquèmia i va induir característiques pro-trombòtiques al plasma, cosa que podria influir en el desenvolupament de coàguls cerebrals i en l'eficàcia de les teràpies trombolítiques amb tPA (únic fàrmac disponible per tractar l'ictus isquèmic en fase aguda).La contaminación del aire en las ciudades está compuesta por material particulado (PM), gases, compuestos orgánicos y metales. Sin embargo, se considera que la fracción de material particulado proveniente de la combustión artificial de combustibles fósiles, las llamadas partículas de escape de diésel (DEP), es la más dañina para la salud humana: cuanto más pequeña es la partícula mayor capacidad de penetración tiene y más daño puede infligir. Datos recientes indican que la mortalidad y la morbilidad global de las enfermedades cardiovasculares están fuertemente influenciadas por las acciones perjudiciales de la PM. De las enfermedades cardiovasculares, el ictus es la segunda causa de muerte a nivel mundial y el 85 % son causados por la oclusión de vasos sanguíneos que irrigan el cerebro. Actualmente se cree que la PM contribuye a la patología del ictus isquémico a través de mecanismos de inflamación, pro-trombosis y/o impidiendo procesos de recuperación. Esta tesis tiene como objetivo investigar la posible interacción de las DEP con los mecanismos fisiopatológicos de la isquemia cerebral antes y durante la fase aguda de la enfermedad empleando modelos experimentales que incluyen un modelo murino de isquemia cerebral in vivo, cultivos de células madre neurales (NSC) in vitro y un ensayo turbidimétrico ex vivo de formación de coágulos y lisis inducida por tPA con muestras plasmáticas humanas y murinas. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son enzimas clave relacionadas con las lesiones y la inflamación aguda por ictus, pero también son esenciales en la fase de reparación. En los pulmones de ratones sanos expuestos a DEP durante 3 días (exposición aguda) o 3 semanas (crónica), los niveles de MMPs no se alteraron. Sin embargo, en el cerebro disminuyeron tras la exposición aguda y aumentaron tras la crónica. Además, la exposición crónica redujo las neuronas corticales, mientras que ambas exposiciones mostraron menos NSC en la vía migratoria rostral coincidiendo con resultados in vitro que mostraron menor viabilidad de las NSC en presencia de DEP. Tras la exposición a DEP (aguda/crónica), los ratones fueron sometidos a una oclusión permanente de la arteria cerebral media (isquemia). Sólo en los pulmones del grupo expuesto crónicamente, las MMPs se vieron alteradas junto con una reducción de los macrófagos alveolares y un aumento de los macrófagos intersticiales y monocitos. Sin embargo, la lesión cerebral producida por la isquemia no se vio agravada por la pre-exposición a DEP ni tampoco se alteraron los niveles de MMPs ni el recuento de diferentes células del sistema nervioso central (SNC). Los posibles efectos sistémicos de la exposición a DEP se estudiaron analizando las características trombogénicas/trombolíticas del plasma mediante turbidimetría. En el plasma de ratón y humano se produjeron cambios pro-trombogénicos tras la isquemia, que se exacerbaron en presencia de DEP. La trombólisis se ralentizó en el grupo crónico-isquémico que retornó a parámetros basales en presencia de DEP y se vio acelerada en los plasmas de personas residentes en zonas altamente contaminadas. Sintetizando, las DEP pueden regular la expresión de proteasas cerebrales en animales sanos, así como reducir las poblaciones de progenitores neurales y de neuronas maduras, comprometiendo el balance fisiológico del SNC. Sin embargo, no se ha observado una exacerbación de la lesión isquémica cerebral tras la exposición a DEP, aunque es necesario dilucidar su influencia en fases posteriores de reparación. A nivel sistémico, la exposición a DEP sí influyó en el reclutamiento de leucocitos en los pulmones tras la isquemia e indujo características pro-trombóticas en el plasma, lo que podría influir en el desarrollo de coágulos cerebrales y en la eficacia de las terapias trombolíticas con tPA (único fármaco disponible para tratar el ictus isquémico en fase aguda).Air pollution in cities is composed of particulate matter (PM), gases, organic compounds and metals. However, it is considered that the particulate matter fraction from the artificial combustion of fossil fuels, namely Diesel Exhaust Particles (DEP), is the most harmful for human health. As the particle becomes smaller in size, the more it can penetrate the organs and the more damaging actions it can inflict. Additionally, air pollution is ranked as an important risk factor for mortality and recent data indicates that global mortality and morbidity of cardiovascular disease are strongly influenced by PM damaging actions. Among cardiovascular diseases, stroke is the second leading cause of death globally and 85% of strokes are caused by the occlusion of blood vessels supplying the brain. In this context, PM is thought to contribute to the ischemic stroke pathology through mechanisms of inflammation, pro-thrombosis and/or impaired recovery. This thesis aims to investigate the possible interaction of DEP with the pathophysiological mechanisms of cerebral ischemia before and during the acute phase of the disease, by means of experimental models including an in vivo mouse model of cerebral ischemia, by in vitro Neural Stem Cells (NSC) cultures and by an ex vivo turbidimetric assay of clot formation and tPA-induced lysis with plasma samples from humans and mice. Matrix metalloproteinases (MMPs) are key enzymes related to injury and inflammation in acute stroke but are also essential in post-stroke tissue remodeling. In the lungs of healthy mice exposed to DEP for 3 days (acute) or 3 weeks (chronic), MMPs' levels were not altered. However, in the brain they decreased after DEP acute exposure but raised after chronic exposure. Chronic exposure reduced the amounts of cortical neurons while both exposures showed fewer NSC in the rostral migratory stream matching with in vitro data where NSC viability was compromised. After acute or chronic DEP exposure, mice underwent permanent Middle Cerebral Artery occlusion (ischemia). In the lungs of the chronically exposed group, an altered MMP response was observed along with reduced alveolar macrophages and increased interstitial macrophages and monocytes. However, brain injury produced by brain ischemia was not exacerbated by the pre-exposure to DEP, and no changes in brain MMPs' levels nor in the cell counts of different CNS cells were observed. The potential systemic effects of DEP exposure related to stroke were studied analyzing thrombogenic/thrombolytic plasmatic characteristics through turbidimetry. After ischemia, mouse and human plasma presented pro-thrombogenic features in the presence of DEP, while thrombolysis slowed in the ischemic chronic group returning to basal levels after DEP exposure. Additionally, humans living in high polluted areas presented accelerated thrombolysis compared to individuals living in less polluted areas. In conclusion, this thesis shows that diesel exhaust particulate matter can regulate the expression of brain proteases in healthy animals while reducing the progenitor and mature neuronal pools, compromising the CNS physiological balance. The expected detrimental role of DEP exposure in the context of cerebral ischemia by exacerbating the infarct lesion has not been observed in the tested conditions although the influence in post-stroke repair needs to be elucidated. Systemically, DEP exposure influenced the recruitment of inflammatory leukocyte populations in the lungs after ischemia and induced pro-thrombotic characteristics in plasma which could influence the brain clots in stroke disease and the outcome of thrombolytic therapies which nowadays are the only treatment for ischemic stroke in the acute phase of the disease