Estudio de las roturas de cadena sencilla y de cadena doble en el ADN de espermatozoides microseleccionados y su efecto en ciclos de ICSI

El estudio de la fragmentación del ADN espermático para la evaluación de varones infértiles ha sido de gran interés en los últimos años. Este daño puede ser de cadena sencilla (SSB), mayoritariamente debido a la presencia de estrés oxidativo y relacionado con la capacidad de conseguir un embarazo y la tasa de fecundación; o de cadena doble (DSB), con un origen mayoritariamente enzimático y relacionado con una cinética embrionaria lenta, una menor tasa de implantación y un riesgo elevado de aborto. La fragmentación en el ADN de los espermatozoides se puede estudiar mediante diferentes técnicas como el test Comet (versiones alcalina y neutra), el test de dispersión de la cromatina o el test TUNEL. El primer objetivo de la presente Tesis Doctoral ha sido encontrar una posible explicación a la falta de asociación entre los valores de fragmentación y los resultados reproductivos en tratamientos de Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Para ello, se ha realizado un estudio multimetodológico de la fragmentación con protocolos adaptados para el estudio de espermatozoides microseleccionados bajo criterios de ICSI (ICSI-S). También se han estudiado espermatozoides descartables para ICSI por presentar alteraciones en su movilidad o morfología (ICSI-N). Los resultados muestran la existencia de un sesgo diagnóstico al analizar los valores de SSB y DSB en la muestra de eyaculado en comparación con la subpoblación de espermatozoides candidatos para ICSI. Mientras que los valores de SSB se reducen significativamente en los ICSI-S en comparación con el eyaculado y la muestra tras realizar un Swim-up, los valores de DSB se mantienen en el mismo nivel. Por su parte, los espermatozoides ICSI-N muestran valores incrementados de SSB y DSB, posiblemente relacionado con la presencia de un nivel elevado de estrés oxidativo y de apoptosis abortiva. El segundo objetivo ha sido estudiar el efecto de las roturas de cadena doble en ciclos de ICSI. Se han comparado las tasas de fecundación y euploidía, así como su efecto clínico, tras el uso de un método convencional de preparación seminal (Gradientes de densidad) y tras el uso de un 2 nuevo método de selección microfluídico (dispositivo ZyMōt™ICSI). Previamente, el método convencional ha mostrado una reducción eficiente de los valores de SSB, pero no de DSB. Por el contrario, el dispositivo microfluídico sí ha mostrado resultados prometedores para reducir significativamente los niveles de ambos tipos de roturas. Los resultados muestran que el uso del dispositivo microfluídico permite aumentar la tasa de fecundación en comparación a los Gradientes de densidad, posiblemente debido a la mayor reducción en los valores de SSB. El dispositivo microfluídico también ha permitido aumentar la tasa de euploidía de los embriones obtenidos, especialmente cuando la pareja femenina es menor de 35 años en comparación con el uso del sistema convencional, posiblemente debido a la reducción de los valores de DSB. En cuanto a resultados clínicos, los datos muestran que el uso del dispositivo ZyMōt™ICSI permite obtener mejores tasas de embarazo bioquímico y embarazo clínico y una menor tasa de aborto en comparación con métodos convencionales.The study of sperm DNA fragmentation to evaluate infertile men has been an emerging field during the last years. DNA breaks can affect one or both strands, resulting in Single-Strand Breaks (SSB) or Double-Strand Breaks (DSB). SSB in sperm DNA have an oxidative origin and showed to reduce the chances of achieving a natural pregnancy. DSB have an enzymatic origin and showed to reduce embryo's kinetics, implantation rates and to increase the miscarriage risk. DNA breaks can be studied using different techniques such as the Comet assay (alkaline and neutral versions), the Sperm chromatin dispersion test or the TUNEL test. The main objective of this Doctoral Thesis was to study the effect of sperm DNA damage on Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) treatments. For this purpose, DNA breaks were analysed on microselected sperm candidates for ICSI (ICSI-S). Sperm presenting motility or morphological alterations were also studied (ICSI-N). The results revealed a diagnostic bias when SSB and DSB are measured on the ejaculate sample compared to those values found on ICSI-S. SSB were significantly reduced after semen preparation through a Swim-up procedure and after ICSI selection compared to the ejaculate. On the contrary, DSB were present in sperm after the Swim-up and after ICSI sperm selection in the same proportion than in the ejaculate sample. On the other hand, ICSI-N sperm showed significantly increased values of SSB and DSB compared to the ejaculate, the Swim-up sample and ICSI-S, probably related to high oxidative stress conditions and to the abortive apoptosis process. 3 After showing that conventional methods based on sperm motility may reduce SSB values but do not affect DSB, the second objective of the present Doctoral Thesis was to study the effect of these breaks on reproductive outcomes after ICSI. Fertilization and euploidy rates were compared after using a conventional method for semen preparation (Density gradients) and using a novel microfluidic sperm sorting device (ZyMōt™ICSI). The conventional method has previously shown to reduce SSB values, but not DSB values. On the contrary, the microfluidic device has recently shown to reduce both types of damage. The use of the microfluidic device resulted in better fertilization rates compared to the use of Density gradients. These results might be attributed to a better reduction in SSB values after using the ZyMōt™ICSI. The use of this device also increased the euploidy rate of the obtained embryos after ICSI, especially when the female partner was under 35 years of age. This increase might be attributed to the reduction in DSB values. The use of the microfluidic device also increased the euploidy rate when women were older than 35 years, but the presence of aneuploidies related to women's age persisted. In addition to the second objective, the effect of the microfluidic sorting device on clinical outcomes after ICSI was studied. The use of this device when patients presented high DSB values resulted in better biochemical and clinical pregnancy rates and lower miscarriage rates compared to conventional methods