New approaches for the future of tuberculosis diagnosis. Interpreting conversations between the host and Mycobacterium tuberculosis

La tuberculosis (TB) es una enfermedad de transmisión aérea causada Mycobacterium tuberculosis. Aunque la TB es una enfermedad curable, es la segunda causa de muerte mundial por un agente infeccioso por detrás de la COVID-19. En 2020, alrededor del 41,4% de los pacientes con TB no se diagnosticaron ni se notificaron, contribuyendo a los 1,5 millones de muertes mundiales causadas por TB. La irrupción de la COVID-19 ha revertido años de progreso mundial aumentando la mortalidad causada por TB (anexo 1). Es necesario desarrollar métodos de diagnóstico de TB precisos, alternativos al esputo y accesibles especialmente en los países de ingresos bajos y medios, donde reside la mayor carga de la enfermedad. Actualmente no existe una prueba de referencia de TB pediátrica con suficiente sensibilidad diagnóstica (anexo 2). El artículo 1 describe un conjunto de biomarcadores identificados en suero y plasma mediante inmunoensayos para evaluar diferentes patrones discriminantes entre la infección y la enfermedad por M. tuberculosis en niños (anexo 5). La combinación de IP-10, IFN-γ, ferritina y 25(OH)D mostró una sensibilidad y especificidad óptimas para el desarrollo de un ensayo para el diagnóstico temprano de la TB en niños (93,2 y 90,0%, respectivamente). La orina es una muestra fácilmente disponible y no invasiva, que sería especialmente útil en pacientes incapaces de expectorar y en individuos con enfermedad diseminada, extrapulmonar o no cavitaria. El artículo 2 evalúa el rendimiento del ensayo Fujifilm SILVAMP TB LAM (FujiLAM), una nueva prueba de TB basada en la orina, en pacientes con presunta TB mostrando una buena precisión del ensayo para diagnosticar la TB en pacientes seropositivos y negativos. El artículo 3 evalúa el uso de FujiLAM en niños con presunta TB y sugiere su potencial como diagnóstico en el punto de atención para la TB pediátrica. El desarrollo de las ómicas ha generado nuevos conocimientos de los mecanismos subyacentes a la enfermedad. El artículo 4 identifica un perfil metabólico de la TB en la orina mediante espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) de alto campo, desarrollando modelos capaces de discriminar a los pacientes con TB. Asimismo, el perfil metabólico de la TB se detectó mediante un espectrómetro de RMN portátil de bajo campo y discriminó a los pacientes con TB sin influir en el tipo de TB o tratamiento (anexo 4). El artículo 5 usó la tecnología para identificar las diferencias en la respuesta metabólica de los niños con presunta TB, mostrando diferencias en la huella metabólica de los niños con TB bacteriológicamente confirmada y no confirmada en comparación con los niños con TB poco probable (anexo 4). El artículo 6 describe la huella metabólica urinaria de los pacientes con TB durante el tratamiento hasta su finalización. Al final del tratamiento, los pacientes tenían una huella metabólica similar a la de los controles sanos. Dado el aumento de resistencia a los fármacos anti-TB y fracasos terapéuticos, esta prueba de concepto podría considerarse en los pacientes con TB resistente a los fármacos. El avance de la biología de sistemas en relación con la TB permitiría abordar con mayor precisión cuestiones clínicamente relevantes para el futuro, como el diagnóstico precoz de la TB, la individualización de las terapias preventivas y la predicción del resultado de un régimen de tratamiento (anexo 3). Esta tesis se centra en describir y evaluar nuevos enfoques en la búsqueda de posibles biomarcadores no basados en el esputo que contribuyan a mejorar el futuro diagnóstico de la TB y la evaluación de la respuesta al tratamiento anti-TB.Tuberculosis (TB) is an airborne disease caused by Mycobacterium tuberculosis. Although TB is a curable disease, it is the second leading cause of death globally from an infectious agent after COVID-19. In 2020, about 41.4% of TB patients were not diagnosed or reported, contributing to the estimated 1.5 million annual deaths caused by TB worldwide. In addition, the irruption of COVID-19 has reversed years of global progress in reducing the number of people who die from TB (annex 1). More accurate and accessible non- sputum-based diagnostic methods need to be developed, especially in low- and middle-income countries, where the greatest burden of disease resides. There is currently no paediatric TB reference test with sufficient diagnostic sensitivity (annex 2). The first article of this thesis describes a set of cytokines and a series of individual factors identified from serum and plasma samples by immunoassays to assess different discriminant patterns between M. tuberculosis infection and disease in children (article 1 and annex 5). As a result, the combination of IP-10, IFN-γ, ferritin and 25(OH)D showed the best diagnostic performance, achieving optimal sensitivity and specificity for the development of a promising early TB diagnostic test in children (93.2 and 90.0%, respectively). Urine is a readily available and non-invasive sample, which would be especially useful in patients unable to expectorate and in individuals with disseminated, extrapulmonary, or non-cavitary disease. Article 2 evaluates the performance of the Fujifilm SILVAMP TB LAM assay (FujiLAM), a new urine-based TB test, in patients with suspected TB, showing good diagnostic accuracy to diagnose TB in seropositive and negative patients. With regard to TB risk groups, article 3 evaluates the use of FujiLAM in children with presumptive TB and suggests its potential as a point-of-care diagnostic for paediatric TB. Currently, the development of omics, has allowed the generation of knowledge on the underlying mechanisms of the disease. Article 4 identifies a metabolic profile of TB in urine using high-field nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometry by developing models capable of discriminating TB patients. In addition, the metabolic profile of TB was detected using a low-field portable NMR spectrometer and discriminated TB patients without influencing TB location or treatment (annex 4). This technology was also applied to identify differences in the metabolic response of children with presumptive TB, showing differences in the metabolic fingerprint of children with bacteriologically confirmed and unconfirmed TB compared to children with unlikely TB (article 5 and annex 4). This finding would assist in a more accurate characterisation of TB in the paediatric population. The last study in this thesis describes the urinary metabolic fingerprint of TB patients monitored during treatment to successful completion (article 6), showing differences in the metabolic fingerprint throughout treatment, such that, at the end of treatment, patients have a similar metabolic fingerprint to that of healthy controls. Given the emerging acquisition of resistance to anti-TB drugs and the increase in treatment failures, this proof of concept could be considered for monitoring the response to treatment of patients with drug-resistant TB. Advances in systems biology in relation to TB would address more precisely clinically relevant questions for the future, such as the early diagnosis of TB, the individualisation of preventive therapies, and the prediction of the outcome of a treatment regimen (annex 3). Overall, this thesis focuses on describing and evaluating new approaches in the search for potential non- sputum-based biomarkers contributing to improve future TB diagnosis and the assessment of response to anti-TB treatment