Egfr and pi3k inhibitors as new therapeutics against brain metastasis of breast cancer cells

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O cancro da mama triplo-negativo (TNBC) é amplamente reconhecido como um dos subtipos de cancro da mama (BC) mais devastadores. A falta de diagnóstico apropriado, aliada à natureza agressiva deste tipo de cancro, costuma culminar com o aparecimento de metástases encefálicas. Embora já existam muitos tratamentos para o BC em estágio inicial, o TNBC apresenta menos opções terapêuticas devido à falta de alvos moleculares bem definidos, resultando num mau prognóstico e numa alta taxa de mortalidade. Isto é particularmente relevante quando o TNBC metastiza para o encéfalo, onde a distribuição de fármacos é limitada por uma barreira de permeabilidade restrita – a barreira hematoencefálica (BBB). No entanto, o TNBC tem vindo a ser associado a uma sobreexpressão do recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) que regula diversas vias importantes para a formação das metástases, sendo um potencial alvo terapêutico a ser explorado. Assim, é necessário realizar estudos adicionais para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de metástases encefálicas de BC (BCBM), baseadas na utilização de inibidores de EGFR e/ou PI3K com capacidade de atravessar a BBB, com o objetivo de determinar o seu efeito nos processos de desenvolvimento das células tumorais tais como viabilidade, migração, alterações do ciclo celular e morte celular programada, examinando seu potencial nos alvos moleculares chave da via de sinalização a jusante do EGFR. Para preencher as lacunas no conhecimento atual, delineámos os seguintes objetivos para esta tese: rastrear os efeitos citotóxicos dos inibidores do EGFR, PI3K e duplos (EGFR/PI3K) em células de BC e determinar a concentração que produz metade do efeito inibitório máximo (IC50); determinar a eficácia dos inibidores na migração, alterações do ciclo celular e morte celular programada de modo a identificar os mais promissores, e avaliar o potencial das moléculas candidatas em alvos moleculares chave da via de sinalização a jusante do EGFR com relevância para a erradicação de BCBM. Foi utilizada a linha de células de adenocarcinoma humano (MDA-MB-231 Br4 marcada com GFP), uma linha de TNBC com propensão para formação de metástase no encéfalo. Usámos uma biblioteca de 27 pequenas moléculas, composta por inibidores do EGFR, PI3K e duplos (EGFR/PI3K), capazes de atravessar a BBB, identificadas com base em estudos in silico anteriormente realizados no nosso laboratório. A fim de avaliar a citotoxicidade de cada molécula, foi avaliada a viabilidade das células MDA-MB-231 Br4. Foram utilizados os seguintes critérios para a seleção das moléculas mais promissoras: inclusão de pequenas moléculas de cada um dos grupos; inclusão de moléculas que induziram perda de viabilidade celular superior a 50%; e inclusão de moléculas que promovam uma diminuição da viabilidade dependente da dose e com efeitos significativos a partir da concentração de 1 µM. Com base nesta análise foram selecionados três inibidores de EGFR (molécula 10, 13 e 14), dois inibidores de PI3Kp110β (molécula 22 e 23) e dois inibidores duplos (molécula 25 e 27). Foi determinado o seu IC50, tendo-se verificado que cinco destas moléculas (molécula 10, 13, 23, 25 e 27) apresentaram valores abaixo de 100 μM, sendo as mais auspiciosas para prosseguir nos estudos seguintes. As células MDA-MB-231 Br4 foram tratadas com cada uma das cinco moléculas selecionadas na sua concentração de IC50e procedeu-se à análise da morfologia nuclear. Os resultados mostraram que, ao fim de 24 h, todos os inibidores promoviam uma diminuição do número de células e um aumento de células não viáveis, revelado através do aumento de núcleos picnóticos e apoptóticos, principalmente na presença das moléculas 23, 25 e 27. Em paralelo, foi avaliado o efeito na capacidade de migração de células tumorais, usando um ensaio de raspagem, verificando-se que os inibidores duplos (moléculas 25 e 27) apresentaram o efeito mais notório, reforçando o seu potencial. Além disso, os inibidores duplos parecem desempenhar um papel importante na modulação da expressão da proteína associada à progressão do ciclo celular (ciclina D2), indicado pelo aumento da expressão desta proteína, apontando para a promoção da morte celular pelas moléculas. A análise imunocitoquímica também demonstrou que a proteína associada à proliferação, Ki-67, sofreu alterações na presença de cada inibidor, notório logo 6 horas após o tratamento, sendo mais percetível para a molécula 27. Já a molécula 25 possui um forte efeito contra as células TNBC, uma vez que quase todas as células estão danificadas ao fim de 24 h. Em termos de morfologia das células tumorais, ambas as moléculas começam a ter efeito ao fim de 3 h, sendo claramente visível a alteração no sinal de GFP e a condensação da cromatina nuclear após 6 h, evidenciando-se também uma diminuição significativa no número de células tumorais e uma diminuição na área e perímetro celular e nuclear, nas células que sobreviveram, sendo este efeito mais marcado com a molécula 25. Em relação à modulação da via de sinalização, a destruição precoce e massiva das células induzida pela molécula 25 dificultou a interpretação das alterações nas proteínas estudadas, designadamente o EGFR, a fosfoproteína cinase B (p-AKT), a metaloproteinase da matriz 9 (MMP9) e o fator intensificador de miócitos 2C (MEF2C), não obstante ser evidente a diminuição da proteína forkhead box P1 (FOXP1), um fator de transcrição associado à migração celular. Por outro lado, a molécula 27 apresentou uma clara redução na ativação de AKT, consequentemente reduzindo a expressão dos intervenientes a jusante, como a MMP9 e o MEF2C. No geral, estes resultados revelaram que os inibidores duplos do EGFR e do PI3Kp110β são mais eficazes do que os inibidores simples, o que indica a relevância de terapêuticas multi-alvo. De realçar que tais inibidores duplos podem modular a via EGFR/PI3K, controlando a morte das células tumorais, a migração e o ciclo celular, afetando especificamente alvos a jusante. Assim, coletivamente, os achados obtidos abrem portas para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para combater o BCBM.Triple-negative breast cancer (TNBC) is widely recognized as one of the most devastating breast cancer (BC) subtypes. The lack of timely diagnosis, allied to the aggressiveness of TNBC, usually culminates with the appearance of brain metastasis. Although there are already many treatments for BC in early stage, TNBC has the fewest therapeutic options due to the lack of well-defined molecular targets, resulting in a poor prognosis and a high mortality rate. This is particularly relevant when TNBC metastasizes into the brain, which presents limited drugs delivery by a restricted permeability barrier – the blood-brain barrier (BBB). Therefore, it is imperative to discover new and personalized therapies targeted to specific tumor molecular pathways, such as those involved in tumor cells migration, invasion and proliferation. Importantly, TNBC has been associated with the overexpression of epidermal growth factor receptor (EGFR), which activation leads to downstream effects involving PI3K among other signaling molecules. Thus, additional studies to unravel novel therapeutics for BC brain metastasis (BCBM) treatment, relying on EGFR and/or PI3K inhibitors with ability to cross the BBB should be pursued, aiming to disclose their effect in tumor cellular processes such as viability, migration, cell cycle alterations and programed cell death, examining their potential in key molecular targets in EGFR downstream signaling as well. To fill these gaps in the current knowledge, we outlined the following aims for this thesis: to screen the cytotoxic effects of PI3K, EGFR and dual inhibitors in BC cells and determine the half maximal inhibitory concentration (IC50) of the most cytotoxic ones; to disclose the inhibitors’ efficacy regarding migration, cell cycle alterations and programed cell death in order to identify the most promising ones; and to evaluate the potential of the selected drug candidates in key molecular targets within EGFR signaling cascade with relevance for BCBM abrogation. We used a human adenocarcinoma cell line (MDA-MB-231 Br4 GFP-fused), a TNBC cell line prone to metastasize in the brain. We used a library of 27 drugs candidates, identified in our lab based on in silico predictions as BBB permeant, EGFR inhibitors, PI3K inhibitors and dual inhibitors. In order to evaluate the effects of each drug in MDA-MB-231 Br4 cells viability, an MTT assay was performed and the most cytotoxic compounds were selected. Using the following criteria: inclusion of small molecules of each of the groups; inclusion of those impairing cell viability by more than 50%; and inclusion of drugs promoting a dose-dependent viability impairment with significant effects already observed with 1 µM of the drug, three EGFR inhibitors (molecules 10, 13 and 14), two PI3Kp110β inhibitors (molecules 22 and 23), and two dual inhibitors (molecules 25 and 27) were selected. The IC50 of those molecules was determined, from which five molecules (10, 13, 23, 25 and 27) presented values below 100 μM, auspicious to proceed into following studies. To elucidate their inhibitor potential regarding cell death, MDA-MB-231 Br4 cells were treated with each of the five selected molecules in their IC50 concentration and the nuclei staining was performed. Our results showed that after 24 h, all inhibitors promote a decrease of cells number and an increase of non-viable cells, revealed by pyknotic and apoptotic nuclei, especially in the presence of molecules 23, 25 and 27. In parallel, we evaluated the effect of the candidate molecules in tumor cell migration capacity by the scratch assay, which revealed that the dual inhibitors (molecules 25 and 27) presented the most notorious effects, supporting their potential. Moreover, the dual inhibitors appear to play a role in the modulation of the cell cycle progression-associated protein (cyclin D2), indicated by its increased expression, supporting the drugs-induced cell death promotion. Immunocytochemistry analysis also demonstrated that the proliferation-associated protein, Ki-67, was decreased in the presence of each inhibitor, as early as 6 h after treatment, being more noticeable for molecule 27. The molecule 25 still possesses a strong effect against TNBC cells once almost all cells are completely damaged at 24 h. In terms of tumor cells morphology, both molecules start having an effect after 3 h, altering the GFP signal and inducing nuclear chromatin condensation; moreover, after 6 h it was observed a significant decrease in tumor cells number, with the remaining cells presenting a decrease in cell and nuclei area and perimeter, particularly with molecule 25. Regarding signaling pathway modulation, it’s the massive cell destruction induced by molecule 25, even early in time, difficulted the interpretation of the alterations in studied proteins such as EGFR, phospho-protein kinase B (p-AKT), matrix metallopeptidase 9 (MMP9) and myocyte enhancer factor 2C (MEF2C), whereas a decreased expression of forkhead box protein P1 (FOXP1) was noticed. On the other hand, the molecule 27 presented a clear reduction on the expression of AKT, consequently reducing the expression of the downstream intervenient MMP9 and MEF2C. Overall, these results revealed that small molecule dual inhibitors targeting both EGFR and PI3Kp110β perform better than single inhibitors, pointing to the relevance of establishing a multi-targeting therapeutic approach. Moreover, such dual inhibitors can modulate EGFR/PI3K pathway, controlling tumor cell death, cell migration and cell cycle, specifically affecting downstream targets. So, collectively, the present results pave the way for the development of novel therapeutic strategies to tackle BCBM