Evaluating cortical transcriptomic differences between Alzheimer’s disease PSEN1- mutated mouse models and human patients, and their implications in drug development

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A doença de Alzheimer (AD) é uma doença progressiva e irreversível do sistema nervoso central, sendo atualmente a demência mais prevalente a nível mundial, cuja incidência aumenta com o avançar da idade. Esta patologia caracteriza-se pela acumulação extracelular de placas insolúveis de péptido amiloide-beta (A), e pela acumulação intracelular de proteína tau irregularmente hiperfosforilada sob a forma de agregados fibrilares. Outras características patofisiológicas incluem morte neuronal e perda de sinapses, exacerbação do sistema imunitário e inflamação crónica, e atrofia cerebral. O presente rápido envelhecimento da população mundial prevê, com o aumento da proporção de população envelhecida, um igual aumento da prevalência e incidência de doenças neurodegenerativas associadas à idade, como é o caso das demências, categoria em que se inclui a AD. Atualmente não existe um tratamento eficaz que abrande ou impeça a progressão desta doença, o que, simultaneamente com a escassez de aprovação de novos medicamentos que se tem sentido na última década, constitui uma preocupação social, económica e de saúde pública. Adicionalmente, a maioria dos ensaios clínicos em doenças neurodegenerativas, inclusive em AD, apresenta elevadas taxas de insucesso, especialmente a nível dos ensaios de toxicidade e eficácia. O insucesso nesta fase dos ensaios reflete as dificuldades de transpor os resultados obtidos através dos modelos animais durante os estudos pré-clínicos para a doença humana, sugerindo que esta não será bem representada por estes modelos. Neste sentido, é imperativo avaliar as diferenças moleculares que distinguem os modelos animais e os doentes com Alzheimer em termos da fisiopatologia da doença, e também desenvolver diferentes abordagens que possam auxiliar a descoberta de modelos animais mais representativos da AD. Nesse sentido, este projeto propõe avaliar os perfis de alteração de expressão génica (também referenciadas como alterações transcritómicas) entre amostras de cérebro de controlos e doentes com AD, tanto para amostras humanas como para amostras obtidas a partir de modelos animais, sendo que em ambas as espécies as amostras relativas aos portadores de um fenótipo de doença apresentam mutações no gene da presenilina 1 (PSEN1). Com esta abordagem pretendeu-se comparar os perfis de alterações transcritómicas induzidos pela AD no cérebro obtidos para cada uma das espécies através de modelação linear de dados de microarrays, sendo que para essa análise foi considerada, para além da condição (controlo versus doente), outra informação sobre as amostras como a idade do dador. A interpretação biológica dessas alterações transcritómicas foi feita por análise de alguns genes encontrados diferencialmente expressos, e também com recurso a Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), um método que identifica as vias metabólicas mais desreguladas, tendo por base o perfil das alterações transcritómicas entre as condições em estudo. As amostras de ratinhos com AD consideradas no presente estudo dividem-se em três categorias: (1) animais com mutações exclusivamente a nível do PSEN1, e animais que adicionalmente são portadores de mutações no gene APP, podendo estes ser (2) heterozigóticos ou (3) homozigóticos. Os três modelos mostraram inexistente ou fraca correlação com a doença humana, aquando da comparação dos perfis de alteração transcritómica. Adicionalmente, os dois primeiros modelos não apresentaram diferenças de expressão significativas entre as amostras controlo e as amostras doentes. Considerando que o modelo homozigótico com mutações em PSEN1 e APP foi o único a apresentar alterações a nível do perfil transcritómico, todas as análises e comparações descritas consideraram apenas estes ratinhos. Os resultados mostram que tanto em humano como em ratinho portadores de doença de Alzheimer existe uma sobre-expressão dos genes envolvidos nos mecanismos de regulação do sistema imunitário, nomeadamente a nível de inflamação crónica, e uma diminuição do transporte de neurotransmissores. As restantes vias mais alteradas com a AD diferem entre humano e ratinho, embora a maioria esteja alinhada com a bibliografia existente sobre a patologia. Algumas vias metabólicas também surgiram inversamente desreguladas entre as duas espécies. Genes envolvidos em vias metabólicas de diferenciação, proliferação e apoptose celular, processamento de DNA e RNA, e mecanismos relacionados com o sistema cardiovascular surgiram sobre-expressos na doença humana; enquanto genes envolvidos em vias associadas com atividade sináptica e neuronal, canais de transporte de membrana, e com a diabetes surgiram sub-expressos. Contrariamente, no caso do ratinho, verificou-se um exacerbar da diabetes, juntamente com o de vias metabólicas relacionadas com a colesterol e interações celulares; e sub-expressão de genes envolvidos na atividade mitocondrial e respiração celular, e em mecanismos de expressão génica, nomeadamente a nível do spliceossoma. Realizou-se também uma análise conjunta dos dados de humano e ratinho, com a qual se observou uma maior variância de expressão génica entre os controlos humanos e os indivíduos doentes humanos, comparativamente com os ratinhos controlo e doentes, reforçando a possibilidade de que o desenvolvimento e a progressão da doença em ratinho não sejam demarcados o suficiente para que, a nível do transcritoma, exista uma explícita diferenciação entre as condições de doença e de não-doença. As diferenças de expressão génica para os dados conjuntos foram modeladas linearmente, incorporando nos modelos, como variáveis, informação não só sobre a idade e condição das amostras, mas também sobre a espécie a que pertencem. Deste modo, foi possível isolar o efeito doença do efeito espécie e obter as diferenças transcritómicas ocorridas mais preponderantemente em humano e em ratinho, bem como as diferenças comuns às duas espécies, ou seja, independentes da espécie. Esta análise revelou que a diminuição da atividade neuronal e sináptica está associada à AD, mas que surge menos afetada nos modelos de ratinho comparativamente aos doentes humanos. Quanto aos genes envolvidos nos mecanismos de regulação do sistema imunitário que também se revelam sobre-expressos na doença geral, encontraram-se mais sobre-expressos na doença humana do que no modelo de ratinho considerado. Estas subtis diferenças entre a informação transcritómica do humano e do ratinho sugerem que as dinâmicas associadas à AD possam ser específicas da espécie, reforçando a necessidade de ajustar os modelos animais para que simulem mais eficientemente a patologia humana. Este projeto teve ainda como objetivo encontrar compostos e perturbações genéticas (knockdowns ou sobre-expressões) com potencial de recapitular as diferenças de expressão mais específicas da AD humana, para que possam ser administrados/manipulados em modelos de ratinho com o intuito de melhorar modelos já existentes ou encontrar um novo e aperfeiçoado modelo animal que replique de forma mais fidedigna as alterações decorridas da doença humana. Adicionalmente, também serão de interesse perturbações químicas e genéticas com capacidade de replicar perfis transcritómicos antagónicos daquele encontrado para a generalidade da doença, que possam ser utilizados como novas terapêuticas ou como objetos de estudo dos mecanismos associados à AD. Para o propósito mencionado acima, recorreu-se à base de dados do Connectivity Map, que inclui informação transcritómica para diversas linhas celulares, antes e após lhes serem administrados diferentes compostos ou alterações genéticas. Usando um software desenvolvido no nosso laboratório, cTRAP, podemos, a partir dos perfis de alteração de expressão genética encontrados no nosso estudo, obter as perturbações químicas e genéticas que recapitulem as alterações transcritómicas do nosso interesse. No tempo do estudo, analisou-se apenas as perturbações químicas, fazendo uma separação entre dois grupos de compostos: (1) aqueles com indicações para doenças do foro neurológico e (2) os com indicação de foro não neurológico. Para cada uma das duas categorias foram selecionados os 10 compostos mais relevantes, isto é, aqueles que estatisticamente estão mais correlacionados com as alterações transcritómicas de interesse. Apenas compostos em fase III de desenvolvimento clínico ou disponíveis no mercado foram considerados. A análise similar das perturbações genéticas fica então referenciada para trabalho a desenvolver no futuro. Adicionalmente, dada a complexidade celular do sistema nervoso central em termos de heterogeneidade e proporção celular, a qual é afetada em estados de doença, e especificamente neste caso de doenças neurodegenerativas, seria de interesse acrescentar uma assinatura que distinga os vários tipos celulares à informação proporcionada ao modelo linear utilizado para derivar os perfis de alteração transcritómica. Desta forma, seria possível distinguir alterações de expressão genética associadas a mudanças na composição celular daquelas relacionadas com mecanismos específicos da AD. O objetivo final do projeto será testar perturbações químicas e genéticas escolhidas cuidadosamente, em linhas celulares e em modelos de ratinho, e testar a sua capacidade em gerar um modelo animal cujo desenvolvimento e progressão da AD seja mais similar ao observado em condições de doença humana; bem como o potencial dos mesmos em reverter características desta patologia.Alzheimer’s disease (AD) is a progressive and irreversible neurodegenerative disease of the central nervous system, being nowadays considered the most prevalent age-related dementia worldwide. AD pathology is characterized by the extracellular deposition of insoluble amyloidbeta plaques, and the intracellular accumulation of abnormally phosphorylated tau protein into neurofibrillary tangles. Other hallmarks include neuronal death, exacerbation of the immune system and chronic inflammation, synaptic loss, and brain atrophy. The world population is rapidly aging, and an increase in the older population is foreseen, as well as in the prevalence of dementias such as AD. Currently, there is no effective treatment to neither decrease nor cease the damage of this disease, which, allied with the lack of new approved medicines since 2003, comprises a social, economic and health burden. Moreover, clinical trials have been exhibiting high failure rates, especially during toxicity and efficacy assessments, which implies a poor representation of the actual human disease in preclinical animal models. Thus, it is vital to evaluate what molecularly distinguishes them in terms of disease pathophysiology, and how can they be improved to better represent the human disease. On this note, this project purposes to assess the dissimilarities between the AD-induced gene expression (i.e. transcriptomic) alterations between preclinical AD mouse models and human AD patients, both carrying mutations in the PSEN1 gene. For this purpose, microarray data was used for both species, and gene expression differences between AD and non-AD conditions were assessed through linear modelling for each specie. To unveil the biological meaning behind this changes, gene set enrichment analyses (GSEA) were performed. Mechanisms associated with the immune system, namely with the inflammatory response, appear up-regulated in both human AD patients and mouse models, whereas neurotransmitter trafficking processes appear down-regulated in both. The majority of the other most strikingly disrupted pathways varied between human and mouse, but were often in accordance with prior scientific knowledge on AD. However, a few of them appeared differently altered between species, such as diabetes mellitus associated pathways, that appeared down-regulated in human patients and up-regulated in AD mouse models. The analysis of the joint dataset (resulting of merging the human and mouse datasets) unveiled synaptic and neuronal activity -related pathways as down-regulated in the disease common to both species, but less so in mouse AD compared to human patients. On the other hand, immune system genes and pathways were commonly up-regulated in the disease but more so in the human patients. These subtle variations between human and mouse transcriptomic information suggest that disease dynamics are potentially species-specific and reinforce the need to generate models that are able to more effectively replicate the human disease. Additionally, we also identified compounds able to induce GE alterations opposite to those observed for the species-common component of the disease, as well as those capable of emulating human-specific AD-induced transcriptomic alterations. Those candidate compounds can be further explored as therapeutics to combat AD or as a vehicle to obtain novel and innovative mouse models that more effectively replicate the transcriptomic signature of the actual human disease. Two groups of compounds were considered: those with prescription information for neurology-related conditions and those prescribed for other conditions. Moreover, only compounds positioned at the phase III of clinical trials or already available in the market were considered. For future work, it would be possible to perform a similar analysis but to assess genetic perturbations (i.e. knockdowns or overexpression) rather than compounds, which could, likewise, be able to induce an opposite transcriptomic profile to that of the species-common disease, and of those that could promote the development of a human AD signature in a mouse model. Moreover, given the complexity of the brain in terms of cell type composition and interactions between cell types, and the consequences of a neurodegenerative disease upon these, it would be interesting to incorporate brain cell-type-specific signatures as explanatory variables in the linear model used to estimate GE changes, in order to decouple AD-associated cell-type-specific and systemic GE alterations from brain cellular composition changes (namely neuronal loss). The end goal of the present project would be to evaluate the effects of carefully selected genetic perturbations and compounds in cell lines and mouse models, in order to obtain a model able to more accurately develop the human AD.Com o patrocínio do Instituto de Medicina Molecular (iMM) João Lobo Antunes