Stress-induced neuronal activation in the medial prefrontal cortex. Identification, molecular profiling and manipulation of stressor-specific neuronal populations

L’exposició a estrès s’ha associat al desenvolupament de malalties psiquiàtriques, encara que les seves conseqüències depenen considerablement de les característiques dels estímuls estressants. No obstant això, disposem de pocs coneixements sobrecom les particularitats dels estímuls estressants (com naturalesa o intensitat) afecten el seu processament cerebral. L’escorça prefrontal medial (mPFC) participa en la regulació de les respostes conductuals i neuroendocrines a l’estrès, però les dades experimentals són contradictòries. Per això, els principals objectius d’aquesta tesi han estat identificar en mPFC poblacions neuronals específiques de diferents estímuls estressants i el seu perfil molecular, així com manipular-les per a estudiar el seu paper. Els experiments s’han realitzat en rates mascle Sprague-Dawley adultes. Per a identificar neurones potencialment específiques de cada estímul estressant, vam caracteritzar la dinàmica d’expressió dels transcrits intrònic i madur de c-fos utilitzant doble hibridació in situ fluorescent. Vam combinar una exposició única o exposició a dos estímuls (xoc inescapable, IS i immobilització, IMO) amb temps apropiats per a identificar neurones únicament activades per l’últim estímul (intrònic+), pel primer (madur+), o per tots dos (intrònic+, madur+). L’anàlisi de colocalització va demostrar que IMO i IS recluten un gran nombre de neurones comunes i un nombre relativament petit de neurones específiques d’estímul, presumiblement les més importants per a determinar les diferents conseqüències entre ambdós estímuls. Posteriorment vam comparar els perfils moleculars de les neurones de l’escorça prelímbica (PL) activades en resposta a diferents estímuls estressants mitjançant la tècnica PhosphoRiboTRAP, consistent en la inmunoprecipitación de la proteïna ribosomal S6 fosforilada (marcador d’activació neuronal) i la consegüent seqüenciació de l’ARNm associat als ribosomes (traductoma). L’estudi del traductoma en resposta a restricció de moviment (RES), IMO o IS va mostrar un gran nombre de gens diferencialment expressats en comparació amb la condició basal, així com una gran proporció de gens compartits pels estímuls. El perfil molecular general de IMO i RES va ser altament similar, malgrat les seves diferències en intensitat, però clarament diferent de IS, indicant una important contribució de la naturalesa particular dels estímuls. Les nostres dades suggereixen una possible petjada molecular específica de cada estímul estressant en PL. Finalment, vam dissenyar un vector viral en el qual l’expressió del receptor DREADD activador o inhibidor estava controlada pel promotor de c-fos (dependent d’activitat), per a reactivar o inhibir, respectivament, les neurones de PL prèviament activades per estrès. L’exposició a IS va incrementar l’expressió del vector viral 4 h més tard, validant així la nostra aproximació. Els animals exposats a IS van mostrar una reducció de l’activitat i l’exploració en ambients nous i un modest impacte sobre l’afrontament en la natació forçada (FST). La reactivació de les neurones de PL no va afectar l’impacte de IS en activitat o exploració, però va incrementar les estratègies d’afrontament passiu al FST i va interferir amb la consolidació de la memòria de la por. La inactivació de les neurones de PL no va tenir efectes excepte un increment de l’exploració en rates no exposades a IS. A nivell hormonal, la reactivació neuronal va reduir la resposta de corticosterona a les proves conductuals tant en animals controls com exposats a IS, amb un patró oposat amb la inhibició neuronal. Per tant, la manipulació neuronal va mostrar efectes molt modestos a nivell conductual, però va apuntar a una funció inhibidora tònica sobre la resposta de corticosterona a l’estrès emocional. En conjunt, els nostres resultats demostren l’existència de poblacions neuronals específiques d’estímul estressant en mPFC, aporten informació rellevant sobre les diferències entre estímuls respecte al perfil molecular de neurones activades en PL i suggereixen una possible implicació d’aquestes neurones en la resposta conductual i hormonal a estímuls estressants.La exposición a estrés se ha asociado al desarrollo de enfermedades psiquiátricas, aunque sus consecuencias dependen considerablemente de las características de los estímulos estresantes. No obstante, apenas conocemos cómo las particularidades de los estímulos estresantes (v.g. naturaleza o intensidad) afectan a su procesamiento cerebral. La corteza prefrontal medial (mPFC) participa en la regulación de las respuestas conductuales y neuroendocrinas a estrés, pero los datos experimentales son contradictorios. Por ello, los principales objetivos de esta tesis han sido identificar en mPFC poblaciones neuronales específicas de distintos estímulos estresantes y su perfil molecular, así como manipularlas para estudiar su papel. Los experimentos se han realizado en ratas macho Sprague-Dawley adultas. Para identificar neuronas potencialmente específicas de cada estímulo estresante, caracterizamos primero la dinámica de expresión de los transcritos intrónico y maduro de c-fos usando doble hibridación in situ fluorescente. Combinamos una exposición única o exposición a dos estímulos (choque inescapable, IS e inmovilización, IMO) con tiempos apropiados para identificar neuronas únicamente activadas por el último estímulo (intrónico+), por el primero (maduro+), o por ambos (intrónico+, maduro+). Los análisis de colocalización demostraron que IMO e IS reclutan un gran número de neuronas comunes y un relativo bajo número de neuronas específicas de estímulo, presumiblemente las más importantes para determinar las distintas consecuencias de los dos estímulos. Comparamos posteriormente los perfiles moleculares de las neuronas de la corteza prelímbica (PL) activadas tras diferentes estímulos estresantes mediante la técnica de PhosphoRiboTRAP, consistente en la inmunoprecipitación de la proteína ribosomal S6 fosforilada (un marcador de activación neuronal) y la consiguiente secuenciación del ARNm asociado a los ribosomas (traductoma). El estudio del traductoma en respuesta a restricción de movimiento (RES), IMO o IS mostró un gran número de genes diferencialmente expresados en comparación con la condición basal, así como una gran proporción de genes compartidos por los distintos estímulos. El perfil molecular general de IMO y RES fue altamente similar, a pesar de sus diferencias en intensidad, pero claramente diferente de IS, indicando una importante contribución de la naturaleza particular de los estímulos. Nuestros datos sugieren una posible huella molecular específica de cada estímulo estresante en PL. Finalmente, diseñamos un vector viral en el que la expresión del receptor DREADD activador o inhibidor estaba controlada por el promotor de c-fos (dependiente de actividad), para posteriormente reactivar o inhibir, respectivamente, las neuronas de PL previamente activadas por estrés. La exposición a IS incrementó la expresión del vector viral 4 h más tarde, validando así nuestra aproximación. Los animales expuestos a IS mostraron una reducción de la actividad y la exploración en ambientes nuevos y un modesto impacto sobre el afrontamiento en la natación forzada (FST). La reactivación de las neuronas de PL no afectó al impacto de IS en actividad o exploración, pero incrementó las estrategias de afrontamiento pasivo en el FST e interfirió con la consolidación de la memoria del miedo. La inactivación de las neuronas de PL no tuvo efectos salvo un incremento de la exploración en ratas no expuestas a IS. A nivel hormonal, la reactivación neuronal redujo la respuesta de corticosterona a las pruebas conductuales tanto en animales controles como expuestos a IS, con una tendencia opuesta tras la inhibición neuronal. Por consiguiente, la manipulación neuronal mostró efectos muy modestos a nivel conductual, pero apuntó a una función inhibidora tónica sobre la respuesta de corticosterona al estrés emocional. En conjunto, nuestros resultados demuestran la existencia de poblaciones neuronales específicas de estímulo estresante en mPFC, aportan información relevante sobre las diferencias entre estímulos respecto al perfil molecular de neuronas activadas en PL y sugieren una posible implicación en la respuesta conductual y hormonal a estímulos estresantes.Stress exposure has been associated with the development of psychiatric disorders, but its consequences are strongly dependent on the characteristics of the stressors. However, little is known about how stressor particularities (e.g. nature or intensity) affect their brain processing. The medial prefrontal cortex (mPFC) plays a role in the regulation of behavioural and neuroendocrine responses to stressors, but experimental data are controversial. Hence, the main objectives of this thesis have been to identify in the mPFC stressor-specific neuronal populations and describe their molecular profile as well as manipulate these neuronal populations in order to elucidate their role in the regulation of the stress response. Experiments were conducted in adult male Sprague-Dawley rats. To identify potential stressor-specific mPFC neurons, we first characterised the dynamics of expression of c-fos intronic and mature transcripts by double in situ hybridisation fluorescence. We combined a single or double exposure to stress (inescapable footshock, IS and immobilisation, IMO) with appropriate times to identify neurons activated only by the last stressor (intronic+), only activated by the first stressor (mature+) and those activated by both (intronic+, mature+). Colocalization analyses revealed that IMO and IS recruit a high number of overlapping neurons and a relatively low number of stressor-specific neurons, which could presumably be the most important ones to determine the differential behavioural and physiological consequences of the two stressors. We further compared the molecular profile of neurons of the prelimbic cortex (PL) activated in response to different stressors by using the PhosphoRiboTRAP approach, which consists on the immunoprecipitation of the phosphorylated ribosomal protein S6, a marker of neuronal activation, and subsequent sequencing analysis of the mRNA associated with the ribosomes (translatome). Translatomic profiling of activated neurons in response to restraint (RES), IMO or IS showed numerous genes differentially expressed versus basal conditions, and a substantial proportion of them was shared by the three stressors. The overall molecular profile of IMO and RES was strikingly similar despite they have different stress intensities, whereas that of IS markedly differed from the other two stressors, indicating a major contribution of the particular nature of the stressor. Our data suggest a potential stressor-specific molecular signature in the PL. Finally, we designed a viral vector expressing either the excitatory or inhibitory DREADD under the control of the c-fos promoter (activity-dependent) to either reactivate or inhibit, respectively, stress-activated PL neurons. Exposure to stress (IS) significantly increased viral vector levels 4h later compared to basal conditions, thereby validating our approach. IS-exposed animals showed a reduced activity and exploration in novel environments and modest effects on coping strategies in the forced swim test. PL neuronal reactivation did not affect behavioural consequences of IS in activity or exploration, but increased passive coping strategies in the FST and interfered with consolidation of fear memory. PL neuronal inactivation did not show marked behavioural effects, except for increased exploratory activity in stress-naïve rats. At the hormonal level, PL neuronal re-activation significantly reduced corticosterone response to the behavioural tests both in stress-naïve and IS animals, with an opposite pattern after neuronal inhibition. Therefore, although neuronal manipulation at the behavioural level showed very modest effects, our results point towards a tonic inhibitory role of PL neurons in modulating the corticosterone response to emotional stress. Together, our findings demonstrate the existence of stressor-specific neuronal populations in the mPFC, provide key insights into the differences between stressors with regard to the molecular profile of activated neurons in the PL, and suggest a possible implication of these neurons in the behavioural and hormonal stress response.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurocièncie