Developing a fluorescent dual-labeling method of the human transcription factor Yin Yang 1

Białko Yin Yang 1 jest wielofunkcyjnym czynnikiem transkrypcyjnym, należącym do grupy białek samoistnie nieuporządkowanych, który bierze udział w istotnych dla funkcjonowania organizmu procesach. Ludzkie białko YY1 składa się z 414 reszt aminokwasowych, a jego budowę można podzielić na dwie części: C-końcową domenę wiążącą DNA, zawierającą palce cynkowe oraz nieustrukturyzowaną N-końcową część o funkcjach regulatorowych (NTF). W niniejszej pracy podjęto próbę uzyskania preparatów białkowych YY1 pełnej długości z modyfikacjami w sekwencji białka, które umożliwiają związanie do nich specyficznych sond fluorescencyjnych. Działanie to miało na celu uzyskanie modelu badawczego, który można będzie wykorzystać do badań metodami spektroskopii fluorescencyjnej, ze szczególnym uwzględnieniem FRET na pojedynczych cząsteczkach. W trakcie prowadzenia badań określono także warunki w jakich możliwe jest cofnięcie zmian konformacyjnych w strukturze drugorzędowej, wywołanych dodatkiem jonów cynku w domenie N-końcowej NTF, które zostały potwierdzone poprzez analityczne Sączenie molekularne. Określono także kinetykę szybkości reakcji znakowania wybranymi fluoroforami dla białek NTF i YY1 pełnej długości, co ostatecznie pozwoliło ustalić warunki znakowania podwójnego. Uzyskane wyniki są obiecujące i dają nadzieję do wykorzystania przygotowanych białek w dalszych badaniach.The Yin Yang 1 protein is a multifunctional transcription factor belonging to the group of intrinsically disordered proteins, involved in the processes, which are crucial for the functioning of the body. The protein consists of 414 amino acid residues, and its structure can be divided into two parts: the C-terminal DNA-binding domain, containing four zinc fingers, and the unstructured, regulatory N-terminal fragment (NTF).In this study, the attempt was made to prepare a full-length YY1 protein, that has particular modifications in the sequence, which enable for specific fluorescent labeling. The purpose of this work was to obtain a model that can be used in fluorescence spectroscopy methods, especially in single-molecule FRET. The research determined the conditions possible to reverse conformational changes in the secondary structure of NTF, which are caused by zinc ions. It has been confirmed by analytical size exclusion chromatography. For full-length YY1 and NTF proteins, kinetic rates of labeling were determined, which allowed the fluorescent dual labeling conditions to be established. The results obtained in this work are promising and give hope for the use of the prepared proteins in further research