Aportes a la producción sustentable de soja mediante el mejoramiento genético de los rizobios

Tesis presentada para optar al título de Doctora en el área Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2022La soja es el cultivo que consume más inoculantes a nivel global. Estos inoculantes están basados casi en su totalidad en cepas relacionadas de las especies Bradyrhizobium japonicum y Bradyrhizobium diazoefficiens. Actualmente, se han reportado numerosas evidencias empíricas acerca de la mayor eficiencia de colonización de soja de B. japonicum por sobre B. diazoefficiens. Sin embargo, los mecanismos moleculares relacionados con estas diferencias de eficiencia de simbiosis permanecen desconocidas. En esta tesis doctoral, la secuenciación de los genomas de cuatro mutantes espontáneas resistentes a estrés oxidativo derivadas del inoculante comercial B. japonicum E109 combinado con estudios moleculares y fisiológicos permitió la identificación de un cluster antioxidante (BjAC) que contiene un regulador transcripcional (glxA) que controla la expresión de una catalasa (catA) y una fosfatohidrolasa (yfbR) relacionadas con las hidrólisis de peróxido de hidrógeno y nucleótidos oxidados, respectivamente. La integración de análisis de sintenia y filogenia sugieren la emergencia del cluster BjAC en la especie B. japonicum E109 luego de su divergencia con el linaje de B. diazoefficiens. La transformación de la cepa modelo B. diazoefficiens USDA110 con el cluster BjAC de la cepa E109 incrementó significativamente su habilidad de colonizar raíces de soja, recapitulando experimentalmente los beneficios de la ocurrencia de BjAC en B. japonicum. Ensayos de inoculación en soja mostraron que la mutación en el gen glxA aumenta la competitividad de nodulación y la actividad PGRP de la cepa E109. Una amplia variedad de mecanismos de resistencia a glifosato ha sido reportada en distintos organismos. Sin embargo, la emergencia de la resistencia a glifosato en rizobios no ha sido estudiada a nivel génico. En esta tesis doctoral, la secuenciación del genoma de mutantes espontaneas resistentes a glifosato derivadas de la cepa E109 permitió la identificación de genes probablemente asociados con la incorporación (gltL y cya) y la degradación (zigA y betA) del glifosato, así como con la fijación de nitrógeno (nifH). Estas mutaciones reducen la inhibición del crecimiento inducida por el glifosato en cultivos bacterianos puros e in plata. Así, todas las mutaciones descriptas conducen a fenotipos capaces de revertir los efectos bacteriostáticos del glifosato. Además, la mutación S90A en la proteína NifH incrementó la actividad citrato sintasa, la tasa de crecimiento y la actividad PGPR en ausencia de glifosato. Estos resultados sugieren que esta mutación contribuye a mitigar el efecto bacteriostático del glifosato vía un incremento en la actividad metabólica celular y sugiere que este sitio de fosforilación juega un papel relevante tanto en vida libre como en simbiosis. Hasta donde sabemos, esta sería la primera evidencia de una función de la nitrogenasa por afuera del proceso de fijación de nitrógeno y un posible rol de este sitio de fosforilación en la modulación del metabolismo. Finalmente, se discute la potencial aplicación de este tipo de microbios mutantes no genéticamente modificados (incluyendo las mutantes espontáneas resistentes a estrés oxidativo y glifosato) en el cultivo de soja a nivel global, tanto para soja transgénica (GMO) como para soja convencional (non-GMO) o editada.Soybean is the most inoculant-consuming crop in the world, carrying strains belonging to the extremely related species Bradyrhizobium japonicum and Bradyrhizobium diazoefficiens. Currently, it is well known that B. japonicum has higher efficiency of soybean colonization than B. diazoefficiens, but the molecular mechanism underlying this differential symbiotic performance remains unclear. In the present doctoral thesis, genome resequencing of four spontaneous oxidative stress-resistant mutants derived from the commercial strain B. japonicum E109 combined with molecular and physiological studies allowed identifying an antioxidant cluster (BjAC) containing a transcriptional regulator (glxA) that controls the expression of a catalase (catA) and a phosphohydrolase (yfbR) related to the hydrolysis of hydrogen peroxide and oxidized nucleotides. Integrated synteny and phylogenetic analyses supported the fact that BjAC emergence in the B. japonicum lineage occurred after its divergence from the B. diazoefficiens lineage. The transformation of the model bacterium B. diazoefficiens USDA110 with BjAC from E109 significantly increased its ability to colonize soybean roots, experimentally recapitulating the beneficial effects of the occurrence of BjAC in B. japonicum. In addition, the glxA mutation increased the nodulation competitiveness and plant growth-promoting efficiency of E109. A variety of glyphosate resistance mechanisms, including target alteration and control of the uptake, export and degradation of glyphosate, has been reported in different organisms. However, the emergence of glyphosate resistance in rhizobia has not been studied at genetic level. In the present doctoral thesis, the genome resequencing of spontaneous glyphosate-resistant mutants derived from the soybean inoculant Bradyrhizobium japonicum E109 allowed identifying genes associated with the uptake (gltL and cya) and degradation (zigA and betA) of glyphosate as well as with nitrogen fixation (nifH). Mutations in gltL, cya, zigA, betA and nifH reduce the initial lag phase under glyphosate stress, supporting the contribution of these mutations to bypass the bacteriostatic effects of glyphosate. In addition to glyphosate resistance, mutation of the serine 90 phosphorylation site of NifH to alanine increased the citrate synthase activity, growth rate and plant growth-promoting efficiency of E109 in absence of glyphosate stress. These results suggest that this mutation contributes to mitigating the bacteriostatic action of glyphosate via an increased metabolic activity, and indicates that this phosphorylation plays roles during both the free-living and symbiotic growth stages of rhizobia. To our knowledge, this is the first report to describe a function of nitrogenase, in particular NifH, besides nitrogen fixation and a possible role of its phosphorylation site in the modulation of metabolism. Finally, the potential applications of these types of non-genetically modified mutant microbes (spontaneous oxidative stress-resistant and glyphosate-resistant mutants) in soybean production worldwide are discussed.Instituto de GenéticaFil: Liebrenz, Karen Ivana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Liebrenz, Karen Ivana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Liebrenz, Karen Ivana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin