Identification of TWIST1 Transcription Factor Target Genes in Breast Cancer Cells By Transcriptome Analysis

Yüksek Lisans TeziMeme kanseri, Dünya’da kadınlar arasında yaygın görülen multifaktöriyel bir hastalıktır. Kansere bağlı ölümlerin büyük çoğunluğu, metastaza bağlı olarak meydana gelmektedir. Günümüzde kanser metastazının hücrelerin epitelyal-mezenkimal transisyon (EMT) süreci ile başladığı bilinmektedir. Bu sürecin temel tetikleyicilerinden biri, TWIST1 transkripsiyon faktörüdür. Bu tez çalışmasında endojen olarak TWIST1’i yüksek düzeyde ifade eden metastatik MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde anti sense oligonükleotidler yardımı ile TWIST1 geninin baskılanması ve buna bağlı olarak değişen transkriptom profili ile hedef genlerin belirlenmesi amaçlandı. Bunun için antisense-TWIST1 cDNA dizisi klonlanmış pcDNA3.1 plazmid vektörü ve kontrol olarak boş plazmid vektörü, hücrelere lipofektamin yardımı ile transfekte edildi. Transfekte edilen hücreler, G418 içeren ortamda kültüre edilerek seçildi. Seçilen tek koloni 3 ay boyunca seçici besiyerinde çoğaltıldı ve protein lizatları elde edildi. Western blot yöntemi ile TWIST1 baskılanması protein düzeyinde doğrulandı. Söz konusu hücrelerden izole edilen RNA örneklerine ait transkriptom verileri DNBseq platformu aracılığıyla analiz edildi. Bu verilerin analiz sonuçlarına göre; 633 adet gen 2-kat ve daha fazla ifade artışı gösterirken, 604 adet farklı genin ise 2-kat ve daha fazla azalış gösterdiği saptandı. Bu genler içinde dikkate değer bir çoğunluğunun hücre membranı ve hücre dışı komponentler ile ilişkili olduğu anlaşıldı. Bu genlerden integrin sinyali ile ilişkili olan; İntegrin beta-8, İntegrin-1 binding protein, İntegrin alfa-3, Talin-1, Filamin-beta, PAR6-Beta, Fibronektin, Aktinin alfa-1, Kollajen-5A2, Kollajen-4A2, Kollajen-3A1 ve Kollajen-12A1 genleri olası TWIST-1 hedef genleri olarak belirlendi. Seçilen bu genlerin ifade değişimleri qRT-PCR yöntemi ile doğrulandı. Bulgulara göre, TWIST1’in baskılanmasına bağlı olarak İntegrin beta-8 ve Kollajen-3A1 gen ifadeleri artarken diğerlerinin doğru orantılı olarak azaldığı saptandı. Sonuç olarak, TWIST1 transkripsiyon faktörünün İntegrin yolağı üzerinde önemli bir regülatör olduğunu ve bu bağlamda önemli bir terapötik hedef olarak değerlendirilebileceği düşünülmektedir.Breast cancer is a multifactorial disease that is common among women around the world. The majority of cancer-related deaths occur due to metastasis. Today, it is known that cancer metastasis begins with the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process of cells. One of the main triggers of this process is the transcription factor TWIST1. In this thesis, it was aimed to determine the suppression of TWIST1 with the help of anti-sense oligonucleotides in metastatic MDA-MB-231 breast cancer cells that endogenously express TWIST1 at a high level and accordingly the changing transcriptome profile. For this, the plasmid vector pcDNA3.1 with cloned antisense-TWIST1 cDNA sequence and an empty vector as a control were transfected into cells with the help of lipofectamine. Transfected cells were selected by culturing in medium containing G418. The selected single colony was grown on selective medium for 3 months and protein lysates were obtained. TWIST1 suppression was confirmed at the protein level using the western blot method. The transcriptome data of the RNA samples isolated from the cells in question were obtained via the DNBseq platform. According to the results of the analysis of these data; It was determined that 633 genes showed a 2-fold or more expression increase, while 604 different genes showed a 2-fold or more decrease. A remarkable majority of these genes were found to be associated with cell membrane and extracellular components. Associated with integrin signal from these genes; Integrin beta-8, Integrin-1 binding protein, Integrin alfa-3, Tallin-1, Filamin-beta, PAR6-Beta, Fibronectin, Actinin alfa-1, Collagen 5A2, Collagen-4A2, Collagen-3A1 and Collagen-12A1 genes were identified as possible TWIST-1 target genes. Expression changes of these selected genes were confirmed by qRT-PCR method. Accordingly, it was determined that Integrin beta-8 and Collagen-3A1 gene expressions increased due to the suppression of TWIST1, while the others decreased in direct proportion. According to these findings, it is thought that the TWIST1 transcription factor is an important regulator on the Integrin pathway and can be considered as an important therapeutic target in this context