Discriminazione rapida tra Legionella pneumophila e altre specie di Legionella con metodi molecolari

OBIETTIVI Obiettivi specifici - Da vari anni sono stati descritti diversi metodi molecolari per la ricerca di Legionella che spesso non permettono di discriminare Legionella pneumophila (Lpn) dalle altre specie di Legionella (Lspp). La Legionella è diffusa negli ambienti acquatici naturali ed artificiali, quali fiumi, stagni e laghi, piscine, torri di raffreddamento, acque termali e sistemi di distribuzione idrica ed è importante negli studi epidemiologici identificare i ceppi isolati. Studi recenti indicano che altre specie di Legionella, oltre Lpn, possono essere importanti nell’eziologia di polmoniti acquisite in comunità e che la loro prevalenza può essere sottostimata a causa degli attuali metodi diagnostici spesso inadeguati. L’identificazione delle specie isolate è fondamentale nelle indagini epidemiologiche per riconoscere casi con comune sorgente di infezione, vie di diffusione e distribuzione nelle reti idriche. A tale scopo abbiamo utilizzato una PCR (Polimerase Chain Reaction) seguita da una seminested-PCR per migliorare la ricerca di Legionella e, soprattutto, discriminare rapidamente Lpn dalle altre Lspp. MATERIALI Materiali e metodi – Per la messa a punto del test molecolare, si è utilizzato DNA estratto da ceppi di Lpn ( ceppo di riferimento ATCC 33152 L. pneunophila ssp pneumophila - Culti-Loops) e Lspp (Legionella micdadei) cresciuti su BCYE con L-cisteina e incubati a 37 °C in microaerofilia. L’estrazione del DNA è stata fatta con QIAmp DNA mini kit della QIAGEN. Il test consiste in una prima PCR in cui si utilizzano primer derivati dalla sequenza genica per l’rRNA 16S specifica per tutte le specie di Legionella, seguita da una seminested-PCR con uno specifico primer per Lpn o per Lspp. Per ottimizzare le seminested-PCR, sono state provate diverse concentrazioni di MgCl2 nel mix di reazione di PCR (da 3 a 4 mM) e diverse temperature di annealing per ciascuna coppia di primer (da 55 a 72 °C). RIASSUNTO Risultati – Dalle prove effettuate si è stabilito che le condizioni sperimentali che permettono di distinguere chiaramente Lpn da Lspp attraverso bande specifiche di DNA amplificato visibili su gel d’agarosio generate dalla seminested-PCR, sono la concentrazione di MgCl2 e la temperatura di annealing che devono essere comprese, rispettivamente, tra 3 e 3.5 mM e tra 65 e 70 °C. CONCLUSIONI Conclusioni – Dai risultati sperimentali preliminari, si può affermare che attraverso questo metodo è possibile discriminare facilmente e rapidamente Lpn da Lspp. Ulteriori prove saranno necessarie per stabilirne i vantaggi rispetto ad altri metodi in uso e l’effettiva applicabilità in indagini su campioni ambientali e clinici