Stress ossidativo ed anomalie citoscheletriche nell’Atassia di Friedreich

Il sistema nervoso centrale è estremamente sensibile allo stress ossidativo e la sua difesa è mediata principalmente dal sistema del glutatione. Si suppone che uno squilibrio a livello di questo sistema sia coinvolto nella patogenesi di alcune malattie neurodegenirative tra le quali il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Il glutatione regola le funzioni proteiche attraverso il fenomeno della glutationilazione, ovverosia la formazione di diulfidi misti tra i residui di cisteina ed il glutatione stesso. La glutationilazine può avvenire sia nel corso del metabolismo costitutivo sia durante lo stress ossidativo, rappresentando sia un fenomeno fisiologico che un risposta adattativa ad un’alterazione dello stato redox. Il primo scopo del nostro lavoro è stato quello di valutare quali proteine fossero costitutivamente gluatationilate a livello del sistema nervoso centrale e di analizzare la loro distribuzione topografica. Abbiamo dimostrato la presenza di una uniforme distribuzione delle proteine glutationilate a livello di tutti gli strati corticali della corteccia del cervello e del cervelletto, così come nella sostanza grigia del midollo spinale; l’immunomarcatura risultava chiara a livello dei neuroni, media a livello degli oligodendrociti e debole a livello degli astrociti. Attraverso esperimenti di western blot, immunoprecipitazione e immunofluorescenza abbiamo dimostrato che esiste una glutationilazione preferenziale delle proteine del citoscheletro, in particolare actina, b-tubulina e neurofilamenti erano costitutivamente glutationilate ed il livello della loro glutationilazione aumenteva all’aumentare del livello del trattamento con pro-ossidanti. Nella seconda parte del nostro lavoro abbiamo focalizzato la nostra attenzione sull’atassia di Fredreich, una patologia neurodegenerativa autosomica recessiva causata da mutazioni a livello del gene che codifica per la fratassina, una proteina mitocondriale implicata nel metabolismo del ferro. Dati recenti suggeriscono che la perdita di fratassian provochi un aumento della generazione di radicali liberi con conseguente aumento dello stress ossidativo a livello cellulare ed inattivazione degli enzimi mitocondriali. In un precedente (Pastore et al. 2003, J Biol Chem. 278, 42588-95) lavoro abbiamo dimostrato che un aumento della quantità di glutatione legato alle proteine del citoscheletro provoca una perdita di organizzazione del citoscheletro nei fibroblasti dei pazienti con atassia di Friedreich. Per questo motivo, abbiamo analizzato la glutationilazione delle proteine e la distribuzione di tubulina e neurofilamenti a livello del midollo spinale dei pazienti con atassia di Friedreich, una delle principali sedi della malattia. Per la prima volta abbiamo dimostrato un significativo aumento a livello del pool dinamico della tubulina così come una anomlala distribuzione delle forma fosforilate dei neurfilamenti nei motoneuroni Friedreich. Nelle stesse cellule le anomalie citoscheletriche colocalizzano con un aumento della glutationilazione proteica, mentre le proteine mitocondriali risultano normalmente espresse, suggerendo un potenziale ruolo della glutationilazione nella regolazione redoxdella sopravvienza neuronale e nel controllo della stabilità a livello di assoni e dendriti. I nostri dati ci spingono ad ipotizzare che nei malati con atassia di Friedrech lo stress ossidativo provochi un’aumentata glutationilazione proteica nelle cellule del midollo spinale che può provocare un’ alterazione dell’organizzazione citoscheletrica, responsabile dell’assonopatia “dying-back”.Central nervous system is highly sensitive to oxidative stress and his defense is mediated primary by the glutathione system. An imbalance in this system is supposed to be implicated in the pathogenesis of some neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Glutathione regulates protein functions by glutathionylation, forming mixed disulfides between cysteins and glutathione itself. Glutathionylation can occur during constitutive metabolism such as during oxidative stress, representing both a physiological process and an adaptative response to redox status alteration. The first aim of our work was to evaluate which proteins were constitutively glutathionylated in central nervous system and to analyze their topographic distribution. We showed an uniform distribution of glutathionylated proteins throughout all cortical layers of cerebral and cerebellar cortex as well as throughout the gray matter of the spinal cord; immunohystochemical staining was clear in neurons, mild in oligodendrocytes and weaker in astrocytes. By western blot, immunoprecipitation and immunofluorescence experiments we demonstrated that there is a preferential glutathionylation of cytoskeletal proteins, in detail actin, b-tubulin and neurofilaments were constitutively glutathionylated and the extent of their glutathionylation increases increasing pro-oxidant treatment level. In the second part of our work we focused our attention on Friedreich’s ataxia, a neurodegenerative autosomal recessive disorder caused by mutations in the gene encoding frataxin, a mitochondrial protein implicated in iron metabolism. Current evidences suggest that loss of frataxin causes an increase in free-radical generation, leading to cellular components oxidation and inactivation of mitochondrial enzymes. In a previous work (Pastore et al. 2003, J Biol Chem. 278, 42588-95) we showed that increased levels of glutathione bound to cytoskeletal proteins caused a loss of cytoskeletal organization in fibroblasts of patients with Friedreich’s ataxia. For this reason, we analysed the glutathionylation of proteins and the distribution of tubulin and neurofilaments in the spinal cord of patients with FRDA, one of the main sites of the disease. We found, for the first time, a significant rise of the dynamic pool of tubulin as well as an abnormal distribution of the phosphorylated forms of human neurofilaments in Friedreich’s motor neurons. In the same cells, the cytoskeletal abnormalities co-localized with an increase in protein glutathionylation while the mitochondrial proteins were normally expressed, suggesting a potential role of glutathionylation in redox regulation of neuronal survivor and in the control of axon/dendrite stability. Our results leads us to speculate that in Friedreich’s ataxia oxidative stress causes an increased protein glutathionylation in the cells of the spinal cord that may lead to an alteration of the cytoskeleton organization, responsible of “dying-back” axonopathy