Regolazione dell'espressione genica dell'mRNA di FMR1, responsabile della sindrome dell'X fragile: implicazioni nel ritardo mentale e nella plasticità sinaptica

Le regioni non tradotte localizzate al 5’ ed al 3’ degli mRNA maturi sono di particolare importanza nella regolazione genica. Nel promotore del gene FMR1, responsabile della sindrome dell’X fragile, ci sono siti di inizio della trascrizione multilpli sia nelle cellule linfoblastoidi sia nelle linee cellulari neuronali; questa caratteristica è tipica dei promotori, come quello di FMR1, che mancano della sequenza nota come TATA box. In questo studio ho analizzato la regione 5’UTR del gene FMR1 del cervello umano e di quello di topo. Nel caso delle regioni dell’ippocampo e del cervelletto umane ho identificato l’uso di quattro siti alternativi di inizio della trascrizione, ognuno dei quali co-localizza con delle sequenze chiamate Inr-like (initiator like sequences), comunemente presenti nei promotori che mancano della TATA box. La presenza del quarto sito di inizio non è rilevabile nelle linee cellulari linfoblastoidi indicando una selezione tessuto specifica dei siti di inizio. Dati preliminari indicavano la presenza di trascritti più lunghi, cioè con l’uso dei siti di inizio più distanti, correlati con un incremento delle ripetizioni CGG, lasciando ipotizzare un modello in cui la lunghezza delle ripetizioni influenzi direttamente la trascrizione del gene e in un modo tessuto specifico. Per completare la mia analisi ho diretto la mia attenzione sul promotore del gene FMR1 di topo. Ho studiato la regione 5’UTR in cervelletto e in ippocampo di topi selvatici e di topi modificati geneticamente, CGG ki, in cui sono state annesse circa 100 ripetizioni CGG derivanti dalla corrispondente regione umana. Nel topo però, pur avendo evidenziato l’uso di siti di inizio della trascrizione alternativi, non ho evidenziato nessuna dipendenza dell’uso dei siti dalla lunghezza delle espansioni. In ultimo ho completato lo studio analizzando la poliadenilazione alternativa nella regione 3’UTR del gene umano di FMR1, dal momento che tale meccanismo è spesso associato con la localizzazione tessuto specifica di alcuni mRNA. Usando la tecnica della 3’ RACE ho identificato cinque trascritti con poliadenilazione alternativa, uno contenente la sequenza canonica e gli altri con sequenza non canonica. Da questi dati possiamo dedurre che il gene FMR1 possiede poliadenilazione alternativa ma che questa non sembra essere tessuto specifica. In questo studio ho poi analizzato gli effetti del trattamento antidepressivo sulla espressione genica, in particolare analizzando la regione 3’UTR nel messaggero per αCaMKII (la subunità α della chinasi II Calcio calmodulina dipendente). Gli antidepressivi sono il terzo gruppo di farmaci più venduto nel mondo. Molti di essi sono basati su molecole che, come la fluoxetine, hanno come bersaglio una singola molecola , il trasportatore della serotonina (5-HT). Gli effetti di tali farmaci sono localizzati sia nella pre che nella post-sinapsi, suggerendo che dei cambiamenti nella struttura sinaptica sono correlati alle modificazioni della plasticità sinaptica osservate nei pazienti depressi. Sulla base di queste osservazioni , le molecole chiave del trattamento degli antidepressivi sono recettori, chinasi, neurotrofine e proteine coinvolte nella neurogenesi e nella funzione sinaptica come per esempio αCaMKII. Avvalendomi della metodologia della 3’RACE, ho analizzato se un trattamento acuto con fluoxetina su cellule corticali primarie potesse influenzare l’espressione del mRNA della αCaMKII. Ho evidenziato che, dopo trattamento, si assiste ad una modulazione della poliadenilazione del trascritto di αCaMKII come anche ad un incremento della proteina stessa. Questo indica un cambiamento della sua espressione dopo antidepressivo, lasciando ipotizzare che tale terapia agisce sulla poliadenilazione alternativa del messaggero della αCaMKII per aumentare poi l’efficienza di traduzione della proteina.The 5’ and 3’ untranslated regions (UTRs) play important roles in regulating gene activity. Within the promoter of the human FMR1 gene, responsible for the Fragile X syndrome, there are multiple transcription start sites in both lymphoblastoid and neuronal cell lines, a common feature of other promoters that lack the TATA box initiator element. In this study I have identified a fourth transcription initiation site in human brain tissue, including hippocampus and cerebellum. All four sites co-localize with an initiator (Inr)-like sequence, commonly found at transcriptional start sites within TATA-less promoters. No detectable activity of the fourth site was observed in lymphoblastoid lines, suggesting a tissue-specific determinants of start site selection. Preliminary data indicate that the longer transcripts (upstream Inrs) are expressed at higher levels with increasing CGG repeat number, providing further support for an initiation model in which the CGG repeat element in the FMR1 gene directly modulates upstream initiation, and in a tissue-specific manner. I have also analyzed the presence of alternative transcription start sites in the promoter of mouse FMR1 gene. I compared the wild type mouse with the transgenic mouse CGG ki, that including in the 5’UTR of FMR1 100 CGG repeats of human gene. In mouse analysis I find several multiple initation sites but I did not find any differences in their usage between wild-type and the CGG ki mice. I have also studied alternative polyadenylation usage in the 3’UTR of the human FMR1 gene, since, the presence of alternative polyadenylation sites has been associated with tissue specific localization of other mRNA species. Using 3’RACE methodology, I have identified five polyadenylation sites, one canonical and four non canonical. These preliminary analysis indicates that transcripts containing the different polyadenylation sites are expressed in both human cell lines and human brain tissues. In this study I also investigated the role of UTRs in antidepressants treatment. Antidepressants are the third most commonly sold group of therapeutic agents worldwide. Most of them are based on molecules, such as fluoxetine, that target a single protein in the brain, the serotonin (5-HT) transporter. Effects of depression are probably localized at both pre- and postsynaptic compartments suggesting that changes in synaptic structure are related to the impaired modification in synaptic strength observed in patients with depression. Based on these hypothesis/observations, key target molecules of the antidepressant treatment are receptors, kinases, neurotrophic factors and protein involved in neurogenesis as well as synaptic function such as αCaMKII. I used the 3’RACE to determine if acute treatment of neurons with fluoxetine would change the αCaMKII mRNA expression in mouse neuronal cortical culture. I obtained that fluoxetine treatment induces a shift in the alternative polyadenylation site usage of αCaMKII mRNA as well as an increase in the total αCaMKII protein in cortical primary culture. These results show that the dendritically localized αCaMKII mRNA changes its pattern of expression after antidepressant treatment. They also show that this treatment affects the use of alternative polydenylation allowing neurons to achieve different levels of protein, possibly translating αCaMKII with a higher efficiency. Key Words: 5’ UTR, 3’ UTR, transcription start site, polyadenylation, dendritic mRNAs, neuronal gene expression, synaptic plasticity, fluoxetine