Crescita in vitro ed in vivo dei tubetti pollinici: possibile ruolo delle glucuronidasi nel modulare la plasticità della parete e dell'inibitore delle glucuronidasi presente nello stilo nel regolare la crescita dei tubetti polinici.

Esocitosi ed endocitosi intervengono nella regolazione dei processi di crescita e morfogenesi nelle cellule eucariotiche, in particolare in quelle altamente polarizzate come il tubetto pollinico la cui crescita è localizzata nella regione apicale e avviene attraverso un meccanismo conosciuto come "tip growth" (52). Nella crescita apicale dei pt, oltre al trasporto regolato di vescicole endo - ed eso- citotiche, è necessaria un'azione concertata di enzimi che modifichino la parete (45-48). Recentemente è stata dimostrata la presenza di ß-glucuronidasi (GUS) nelle piante ed è stato proposto un loro ruolo nella crescita per distensione e, in particolare, nella formazione dei peli radicali (49). L’allungamento dei peli radicali è caratterizzato da una crescita polarizzata analoga, in meccanismi e regolazione, a quella presente nei pt (52, 53). E’ quindi particolarmente interessante investigare la presenza di GUS nel polline e il suo eventuale ruolo nella germinazione e crescita dei tubetti pollinici. Contemporanea analisi proteomica condotta in collaborazione con l’unità di Siena potrà identificare eventuali isoforme proteiche attive nel tubetto in crescita. Sulla base di sequenze note dei geni GUS in Arabiopsis (51) e Scutellaria (50) studi di biologa-molecolare verranno condotti sull’mRNA estratto dal polline e dai tubetti pollinici, allo scopo di individuare il/i geni GUS espressi nel polline. Questo potrà consentire in futuro esperimenti di silenziamento genico volti allo studio del ruolo del GUS nella maturazione del polline e nella germinazione e crescita dei tubetti pollinci. Nel nostro laboratorio, è stata inoltre dimostrata la presenza di un inibitore dell'attività glucuronidasica negli stili di Nicotiana (43). Indicazioni preliminari sembrano indicare una sua presenza nello spazio apoplastico e, quindi, un suo possibile ruolo nella regolazione dell’attività GUS associata ai tubetti pollinici e forse della loro crescita. Si intende quindi purificare tale inbitore, caratterizzarlo e studiarne la distribuzione nello stilo in relazione alla crescita dei tubetti pollinici compatibili e incompatibili. Considerato che dati sperimentali indicano che l'inibitore dell'attività GUS viene internalizzato all'interno dei pt durante la crescita nel tessuto di trasmissione stilare, la caratterizzazione-purificazione dell’inibitore e l’utilizzo di polline trasformato con il costrutto “promotore LAT52-GUS” (espresso specificatamente nel polline) apriranno nuove possibilità per studiare in vitro e semi-vivo il fenomeno di endocitosi, particolarmente rilevante per le interazioni pt-stilo. Nell’ambito di questo progetto si intendono quindi perseguire i seguenti obiettivi: - Studio sulla presenza della ß-glucuronidasi (GUS) nei tubetti pollinici (pt): sua caratterizzazione, purificazione e investigazione del ruolo svolto nella germinazione e crescita dei tubetti pollinici. - Purificazione e caratterizzazione dell’inibitore stilare del GUS. - Analisi della distribuzione dell’inibitore in diverse parti dello stilo, in relazione anche al tipo di impollinazione, e suo utilizzo per investigare il processo di internalizzazione nei tubetti polinici