Extracellular ATP: signal molecule in skeletal muscle

Nei muscoli striati, l’attività contrattile produce forti tensioni laterali e di superficie che porterebbero a lacerazioni della membrana cellulare (sarcolemma) se non intervenisse il sistema del membrano-scheletro. Questo complesso di proteine associate alla distrofina, svolge il ruolo essenziale di proteggere la membrana delle fibre muscolari attenuando e ridistribuendo alla matrice extracellulare le tensioni generate dalla contrazione. Il complesso della distrofina, localizzato a livello del sarcolemma, collega infatti direttamente le miofibrille con la matrice extracellulare. Non é quindi sorprendente che alterazioni dei suoi componenti, causate da difetti genici, possano provocare gravi danni alla fibra muscolare. Del complesso del membrano scheletro fanno parte la distrofina, i distroglicani e anche sei glicoproteine transmembrana chiamate sarcoglicani (alfa,beta, gamma, delta, zeta, epsilon-sarcoglicano). L’alterazione di quattro di esse (alfa,beta, gamma, delta) é causa delle gravi distrofie muscolari chiamate sarcoglicanopatie. Si ritiene che i sarcoglicani oltre ad essere coinvolti nelle funzioni strutturali, la loro assenza è spesso associata a danni di membrana, partecipino anche ad una funzione, non ancora definita, importante nella fisiologia muscolare. L’analisi della sequenza aminoacidica dell’alfa-sarcoglicano ha evidenziato, nel dominio extracellulare, la presenza di due putativi siti di legame per l’ATP. Esperimenti con il complesso purificato delle proteine associate alla distrofina ha rilevato la presenza di un’attività ATPasica inibita da un anticorpo che riconosce uno dei due siti di legame per l’ATP dell’-sarcoglicano (Betto et al., 1999). Questi dati hanno quindi suggerito che l’-sarcoglicano possa essere una ecto-ATPasi, cioè un enzima della famiglia delle ecto-nucleotidasi, capaci cioè di idrolizzare ATP extracellulare. Poiché alterazioni di alpha-sarcoglicano sono causa di una grave forma di distrofia muscolare, si può ritenere che l’attività ecto-ATPasica della proteina sia importante per la fisiologia della fibra muscolare e diventi rilevante nel meccanismo patogenetico delle sarcoglicanopatie. Da queste osservazioni deriva il piano sperimentale della tesi rivolto a dimostrare e caratterizzare l’attività ecto-ATPasica di alpha-sarcoglicano, a studiare il segnale dell’ATP extracellulare nel muscolo scheletrico ed il ruolo svolto da -sarcoglicano in questo segnale. La caratterizzazione dell’attività ecto-ATPasica dell’alpha-sarcoglicano è stata condotta in due diversi modelli cellulari: nella linea cellulare di tipo muscolo scheletrico C2C12 e nelle cellule non muscolari HEK-293. Nelle cellule C2C12, la possibile attività enzimatica di alpha-sarcoglicano è stata valutata poiché la proteina viene espressa durante il loro differenziamento; é stato dimostrato, utilizzando un anticorpo che riconosce il sito di legame per l’ATP, che il contributo di alpha-sarcoglicano nell’attività ecto-ATPasica totale é circa il 20-25 %. La caratterizzazione vera e propria dell’attività enzimatica di alfa-sarcoglicano è stata ottenuta con la trasfezione delle cellule di tipo non muscolare (HEK-293). La trasfezione di queste cellule con il cDNA codificante alpha-sarcoglicano ha conferito loro una nuova attività ecto-ATPasica, interamente attribuibile all’-sarcoglicano perché viene completamente abolita dall’anticorpo specifico per la proteina. La caratterizzazione enzimatica nelle cellule HEK-293 trasfettate con l’alfa-sarcoglicano ha infine dimostrato che questo enzima è in grado di idrolizzare sia ADP che ATP con un rapporto 1:3 e che per agire necessita della presenza sia di Ca2+ che di Mg2+. Inoltre sono stati individuati due inibitori specifici dell’enzima, suramina e reactive-blu. L’inserimento dell’alpha-sarcoglicano, una proteina distribuita lungo tutta la superficie della fibra muscolare, nella famiglia delle ecto-nucleotidasi suggerisce che l’ATP extracellulare e, in particolare, la regolazione della sua concentrazione rivestano un ruolo fisiologico importante anche nel muscolo scheletrico, così come si verifica in molti altri tessuti. Perché l’ATP funga da molecola segnale è necessario che quattro condizioni siano rispettate: 1) l’ATP deve essere liberato nell’ambiente extracellulare; 2) devono essere presenti enzimi per la degradazione del nucleotide, e quindi per il controllo e modulazione della sua attività di segnale; 3) devono essere presenti sulle cellule bersaglio recettori specifici per il nucleotide; 4) le cellule bersaglio devono rispondere alla stimolazione. Per studiare il possibile ruolo di ATP extracellulare come molecola segnale del muscolo abbiamo utilizzato la linea cellulare C2C12 che ripercorre, durante il differenziamento, le prime tappe della miogenesi. Lo studio condotto nelle cellule C2C12 ha dimostrato la presenza di tutti gli elementi che permettono all’ATP extracellulare di svolgere la funzione di molecola segnale, funzione che sembra variare durante il differenziamento. Questa osservazione suggerisce che il segnale dell’ATP extracellulare abbia un ruolo attivo nella miogenesi e nella rigenerazione del muscolo scheletrico. In sintesi, é stato dimostrato che nelle cellule C2C12 (mioblasti e miotubi) modestissime quantità di ATP sono liberate nel mezzo extracellulare per diffusione passiva attraverso la membrana, come conseguenza dell’elevato gradiente di concentrazione. Nelle colture di mioblasti l’ATP extracellulare permane a lungo, mentre in quelle di miotubi viene rapidamente degradato. Livelli molto superiori di ATP sono rilasciati dai miotubi, probabilmente mediante un processo attivo, in seguito alla stimolazione elettrica che è in grado di indurre la contrazione dei miotubi stessi. La concentrazione del nucleotide così liberato, anche in questo caso, viene velocemente ridotta. A questo proposito è stata analizzata la capacità di idrolizzare l’ATP delle cellule nelle fasi proliferative e differenziative. L’aumento dell’attività ectoATPasica che si registra nei miotubi è da attribuire all’aumento di espressione di diverse ectonucleotidasi, compreso alfa-sarcoglicano, dimostrato mediante RT-PCR. Anche la sensibilità all’ATP extracellulare cambia dalla fase proliferativa a quella di differenziamento. Infatti, mentre i mioblasti proliferanti e confluenti rispondono all’ATP con transienti di Ca2+ intracellulare ampi e lunghi, i miotubi presentano una minore sensibilità al nucleotide. Considerando le variazioni di espressione dei recettori P2 e l’aumentato numero e attività di enzimi deputati al controllo della concentrazione dell’ATP extracellulare, l’impressione che si ricava é che, con il progredire del differenziamento, la qualità e il ruolo del segnale dell’ATP extracellulare divengano molto più specializzati e siano sottoposti ad un controllo molto più accurato. L’ATP extracellulare sembra quindi una molecola segnale di grande rilevanza per le cellule di tipo muscolare in cui sembra svolgere ruoli diversi a seconda della fase differenziativa e, in questo contesto, che alpha-sarcoglicano abbia una funzione rilevante. Infatti, la sua assenza, causata da difetti genici, provoca nell’uomo una grave distrofia muscolare (Bonnemann et al., 1994). Queste evidenze hanno fornito il razionale per lo studio delle conseguenze dell’assenza di alfa-sarcoglicano nell’attività ecto-ATPasica globale delle cellule. I dati presentati in questa tesi dimostrano che l’assenza dell’-sarcoglicano causa delle modificazioni enzimatiche significative, che potrebbero contribuire a generare il grave fenotipo clinico della distrofia muscolare. La prima evidenza di tali alterazioni é stata osservata in un clone generato dalle cellule C2C12 in cui mediante la produzione di RNA antisenso dell’-sarcoglicano si ottiene la quasi totale assenza della proteina. Analizzando le variazioni riscontrate in questo clone abbiamo osservato una minor capacità differenziativa ma un grande aumento, inaspettato, dell’attività ecto-ATPasica che è risultato però in relazione con variazioni di espressione di altri enzimi capaci di idrolizzare l’ATP. Abbiamo anche utilizzato il topo knock-out per l’alpha-sarcoglicano, dimostrando che l’assenza della proteina produce l’insorgere di una distrofia muscolare con un andamento progressivo simile a quello della patologia umana. Analizzando l’attività ecto-ATPasica sia delle cellule satelliti sia di fibre adulte isolate abbiamo nuovamente riscontrato che l’assenza dell’-sarcoglicano provoca un aumento dell’attività ectoATPasica totale. Per quanto riguarda l’espressione degli altri enzimi per l’idrolisi di ATP si sono osservate variazioni nelle colture primarie di cellule satelliti diverse rispetto a quelle di fibre adulte, suggerendo che il controllo dell’ATP extracellulare sia regolato diversamente in assenza di -sarcoglicano a seconda della fase di maturazione del muscolo. Nell’ultima parte del lavoro di tesi é stata analizzata l’espressione e il possibile ruolo fisiologico di uno dei recettori che rispondono all’ATP, il P2X4. Abbiamo dimostrato la presenza e la localizzazione del recettore e fornito una possibile spiegazione del ruolo che esso svolge nel muscolo scheletrico. Analizzando l’espressione della proteina del recettore abbiamo evidenziato livelli più elevati nei muscoli di tipo lento (soleo) rispetto a quelli di tipo rapido (EDL) ed, in particolare, nelle fibre a prevalente metabolismo ossidativo rispetto a quelle glicolitiche. Studi di colocalizzazione hanno, inoltre, dimostrato che il recettore P2X4 si trova nelle membrane dei tubuli T, una struttura altamente specializzata della fibra muscolare, dove ha sede l’accoppiamento eccitazione-contrazione, suggerendo un suo possibile ruolo in questo meccanismo. Esperimenti di stimolazione di singole fibre in coltura hanno dimostrato che ATP viene liberato dalle fibre suggerendo che il recettore possa essere attivato dopo ogni singola contrazione. Per capire quale ruolo abbia la stimolazione ricorrente del recettore, é stato messo a punto un protocollo di stimolazione prolungata a bassa frequenza (0,05 Hz) del muscolo soleo con cui si osservava il progressivo potenziamento della tensione generata in conseguenza della scossa. Abbiamo ipotizzato che a questo potenziamento possa contribuire l’attivazione del recettore P2X4. Una volta attivato da ATP (liberato ad ogni contrazione), il recettore diviene un canale ionico permeabile al calcio, che entrando nella cellula può essere disponibile per le contrazioni successive. Tutti gli esperimenti effettuati in modo da prevenire l’attivazione del recettore, hanno dimostrato il coinvolgimento di P2X4 in questo fenomeno di potenziamento e, per la prima volta, hanno dimostrano l’occorrenza dell’attivazione purinergica del muscolo scheletrico adulto. In conclusione, i dati presentati in questa tesi hanno consentito la dimostrazione dell’attività ecto-ATPasica di alpha-sarcoglicano e una prima, parziale, caratterizzazione del signalling dell’ATP extracellulare nelle cellule C2C12 e nelle fibre del muscolo adulto. Infine, e forse più importante, é stato dimostrato che l’assenza di alfa-sarcoglicano e della sua attività ecto-ATPasica produce rilevanti disordini dell’attività complessiva delle cellule che potrebbero rappresentare il meccanismo patogenetico delle distrofie muscolari dei cingoli (sarcoglicanopatie)