Rôles de la protéine Damaged-DNA Binding 2 sur l'adhérence, les propriétés nanomécaniques et la voie du TGFβ1 dans les cellules tumorales mammaires

Understanding of molecular mechanisms behind metastatic progression remains a major issue in cancer research and requires discovery of new predictive markers. Thus, the laboratory has highlighted that DDB2 protein (Damaged-DNA Binding 2), usually involved in DNA repair, is an important factor in breast tumorigenesis. Indeed DDB2, by regulating genes encoding MnSOD and IκBα, is associated with increased proliferation and reduced invasive abilities of breast tumor cells. Since migratory and invasive properties are closely related to adhesive properties, the aim of this work has been to study the involvement of DDB2 in breast cancer cell adhesion. To this end, two breast cancer cell lines have been used: low-DDB2 expressing MDA-MB231 cells, in which this protein was overexpressed and MCF7, which endogenously express DDB2 in which its expression was inhibited.First, adhesive properties of cells in which DDB2 expression is modulated, has been assessed, and reveal that DDB2 expression is associated with a decrease of adhesion on neutral surfaces, suggesting that membrane properties and contents could be modified in these cells. Thus, an analysis of nanomechanical properties by atomic force microscopy indicates a decrease of cell stiffness in DDB2-expressing cells. These data could be related to the loss of cortical actin cytoskeleton observed by cytoimmunofluorescence. To understand molecular mechanisms involved in DDB2-dependent modulation of these properties, a transcriptomic study on adhesion-related encoding genes has been performed (PCR array). This investigation reveals that the transcript level of genes encoding TGFβ1, CTGF and ICAM-1 are modulated according to DDB2 expression level in the two cell lines. Second, we have studied the influence of DDB2 on the TGFβ signaling pathway. Our results show that DDB2, when it is overexpressed, promotes an inhibition of Smads transcriptional activity and the TGFβ1-induced gene expression. We have attempted to understand how DDB2 interferes with this pathway. Our results show that DDB2 seems to decrease the phosphorylation of Smads. In addition, we show by chromatin immunoprecipitation that DDB2 promotes a strong decrease of Smads on the promoter of TGFβ1-induced PAI1 gene, by binding near their specific response elements. Taken together, these data indicate that the nanomechanical properties of breast tumor cell membranes and the TGFβ1-induced signaling pathway would be modulated by DDB2. Also, the present work confirms the importance of DDB2 in breast tumorigenesis and contributes to better define this protein as a new pronostic and/or predictive marker of metastatic progression of breast cancer.La compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de la progression métastatique des tumeurs mammaires reste une préoccupation constante dans la recherche en cancérologie et nécessite la découverte de nouveaux marqueurs prédictifs. Dans ce sens, le laboratoire a mis en évidence que la protéine DDB2 (Damaged-DNA Binding 2), connue pour son rôle dans la réparation de l’ADN, était impliquée dans la tumorigenèse mammaire. En effet, l’équipe a montré que la protéine DDB2, en régulant l’expression des gènes codant la MnSOD et IκBα, était associée à une augmentation des capacités prolifératives et à une diminution du pouvoir invasif des cellules tumorales mammaires. Les propriétés invasives des cellules étant étroitement liées à leurs capacités d’adhérence, nous nous sommes intéressés au rôle de DDB2 dans l’adhérence des cellules tumorales mammaires. Deux lignées ont été utilisées : les MDA-MB231 exprimant peu DDB2 et dans lesquelles celle-ci a été surexprimée, et les MCF7 exprimant naturellement la protéine DDB2 et dans lesquelles cette protéine a été inhibée. Dans un 1er temps, l’étude des propriétés d’adhérence des cellules, présentant une modulation de l’expression de DDB2, a révélé une baisse de l’adhérence des cellules exprimant DDB2 sur des supports neutres (plastique et verre), suggérant que les propriétés et la composition membranaires seraient modulées. Ainsi, une analyse des propriétés nanomécaniques par microscopie de force atomique a démontré que l’expression de DDB2 est associée à une augmentation de l’élasticité membranaire des cellules tumorales mammaires. Ces variations d’élasticité membranaire peuvent en partie être dues à une baisse du réseau d’actine corticale observée par cytoimmunofluorescence. Afin de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la modulation de ces propriétés, une analyse transcriptomique par PCR-Array, ciblant spécifiquement l’expression de gènes impliqués dans l’adhérence, a été réalisée. Celle-ci révèle que l’expression des gènes codant le TGFβ1, le CTGF et ICAM-1 est modulée en fonction du niveau d’expression de DDB2 dans les deux lignées cellulaires. Ainsi dans un 2nd temps, nous avons étudié l’influence de DDB2 sur la voie du TGFβ1. Nos résultats montrent que DDB2, lorsqu’elle est exprimée, interfère avec l’activité transcriptionnelle des Smads et l’expression de gènes cibles induite par la voie du TGFβ1. Nous avons tenté de rechercher comment DDB2 interfère avec cette voie. Nos résultats montrent que DDB2 semble diminuer la phosphorylation des protéines Smads. Par ailleurs, nous révélons par immunoprécipitation sur chromatine, que DDB2 entraîne une diminution forte de la présence des Smads sur le promoteur du gène PAI-1 cible du TGFβ1, en se fixant à proximité de leurs éléments de réponse. L’ensemble de ces résultats indique que les propriétés nanomécaniques membranaires des cellules tumorales mammaires et la voie de signalisation induite par le TGFβ1 seraient modulées par DDB2. Ce travail confirme donc l’importance de cette protéine DDB2 au cours de la tumorigenèse mammaire et contribue ainsi à mieux la définir comme un nouveau marqueur pronostique et/ou prédictif de la progression métastatique dans le cancer du sein