Roles of the negative regulatory loop MUC4-miR-210-3p in pancreatic carcinogenesis and and chemoresistance

Contexte : l'adénocarcinome pancréatique (PDAC) est un cancer mortel dontle pronostic est extrêmement sombre. La mucine membranaire MUC4 estnéoexprimée dans les lésions néoplasiques pancréatiques précoces et est associéeà la progression du PDAC et à la chimiorésistance. Dans les cancers, les microARNs(miARNs, petits ARNs non codants) sont des régulateurs cruciaux de lacancérogenèse, de la réponse aux chimiothérapies et même des processusmétastatiques. Dans cette étude, nous avons voulu caractériser les miARNs activésen aval de la signalisation associée à MUC4 dans l'adénocarcinome pancréatique et de mettre en évidence leurs rôles dans la cancérogenèse pancréatique et la résistance aux chimiothérapies.Méthodes : Afin d’identifier les miARNs potentiellement régulés par MUC4, unmiRnome a été réalisé sur les cellules cancéreuses invalidées pour MUC4 (MUC4-KD) et leurs contrôles Mock. Nous avons sélectionné, pour cette étude, le miR-210-3p qui est sous exprimé suite à l’invalidation de MUC4. Nous avons ensuite vouludéterminer ses rôles biologiques dans les PDACs. Le niveau d'expression de miR-210-3p a été analysé par RT-qPCR dans des lignées cellulaires cancéreuses pancréatiques (PANC89, PANC89 Mock et MUC4-KD, PANC-1 et MiaPACA-2), ainsi que dans des tissus de souris et de patients. La régulation réciproque entre MUC4 etmiR-210-3p a été étudiée par des tests fonctionnels tels que des mesures d’activité luciférase et des expériences d'immuno-précipitation de la chromatine. Des lignées cellulaires exprimant stablement le miR-210-3p ou un anti-miR-210-3p ont été établies en utilisant la technologie Crispr/Cas9 ou la transduction lentivirale. Nous avons évalué l'activité biologique de miR-210-3p in vitro en mesurant la prolifération et la migration cellulaire et in vivo en mesurant la croissance tumorale après xénogreffe sous-cutanée des cellules Capan-1 LV-miR-210-3p. Enfin, nous avons évalué l’effet de miR-210-3p sur la réponse aux chimiothérapies gemcitabine et FOLFIRINOX par la réalisation de tests MTT.Résultats : L’invalidation de MUC4 induit une baisse significative de l’expression de miR-210-3p dans les cellules cancéreuses pancréatiques PANC89MUC4-KD. Le miR-210-3p est surexprimé dans les PDACs et son expression est corrélée à l'expression de MUC4 dans les cellules cancéreuses pancréatiques, dans des échantillons de tissus PDAC humains, ainsi que dans des tissus murins du modèle préclinique Pdx1-Cre ; LstopL-KrasG12D développant des lésions PanINs.MUC4 active transcriptionnellement l’expression de miR-210-3p via l’altération de la voie de signalisation NF-κB. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine ont montré la liaison de la sous-unité p50 de NF-κB sur les régions promotrices dumiR-210-3p. Nous avons mis en évidence une régulation réciproque puisque le miR-210-3p réprime l'expression de MUC4 transcriptionnellemment via l’inhibition de la voie du TGF-β SMAD dépendante et post-transcriptionnellement via le 3’UTR. La surexpression transitoire et stable de miR-210-3p dans les cellules PANC89, PANC-1 et MIA PaCa-2 conduit à une baisse significative de la prolifération et de la migration cellulaire. En revanche l’anti-miR-210-3p induit les effets inverses. Enfin,nous avons montré que le miR-210-3p inhibe la croissance et la prolifération des tumeurs pancréatiques in vivo. Nos résultats préliminaires suggèrent également un rôle de miR-210-3p dans la réponse aux chimiothérapies.Conclusion : Nous avons mis en évidence pour la première fois l’existence d’une boucle de régulation entre une mucine et un miARN [...]Background: Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is a deadly cancer with anextremely poor prognosis. MUC4 membrane-bound mucin is neoexpressed in earlypancreatic neoplastic lesions and is associated with PDAC progression andchemoresistance. In cancers, miRNA (small noncoding RNAs) are crucial regulatorsof carcinogenesis, chemotherapy response and even metastatic processes. In thisstudy, we aimed at identifying and characterizing miRNAs activated downstream ofMUC4-associated signaling in pancreatic adenocarcinoma. MiRnome analysiscomparing MUC4-KD versus Mock cancer cells showed that MUC4 inhibitionimpaired miR-210-3p expression. Therefore, we aimed to better understand themiR-210-3p biological roles.Methods: miR-210-3p expression level was analyzed by RT-qPCR in PDACderivedcell lines (PANC89 Mock and MUC4-KD, PANC-1 and MiaPACA-2), as wellas in mice’s and patients’ tissues. The MUC4-miR-210-3p regulation wasinvestigated using luciferase reporter construct and chromatin immunoprecipitationexperiments. Stable cell lines expressing miR-210-3p or anti-miR-210-3p wereestablished using Crispr/Cas9 technology or lentiviral transduction. We evaluated thebiological activity of miR-210-3p in vitro by measuring cell proliferation and migrationand in vivo using a model of subcutaneous xenograft.Results: miR-210-3p expression is correlated with MUC4 expression inPDAC-derived cells and human samples, and in pancreatic PanIN lesions of Pdx1-Cre; LstopL-KrasG12D mice. MUC4 enhances miR-210-3p expression levels viaalteration of the NF-κB signaling pathway. Chromatin immunoprecipitationexperiments showed p50 NF-κB subunit binding on miR-210-3p promoter regions.We established a reciprocal regulation since miR-210-3p repressed MUC4expression via its 3′-UTR. MiR-210-3p transient transfection of PANC89, PANC-1and MiaPACA-2 cells led to a decrease in cell proliferation and migration. Thesebiological effects were validated in cells overexpressing or knocked-down for miR-210-3p. Finally, we showed that miR-210-3p inhibits pancreatic tumor growth andproliferation in vivo.Conclusion: We identified a MUC4-miR-210-3p negative feedback loop inearly-onset PDAC, but also revealed new functions of miR-210-3p in both in vitro andin vivo proliferation and migration of pancreatic cancer cells, suggesting a complexbalance between MUC4 pro-oncogenic roles and miR-210-3p anti-tumoral effects