Development of Quorum Sensing inhibitors for complex biofilms control

Les biofilms bactériens représentent aujourd’hui une menace majeure pour la santé publique mondiale. En effet, ces assemblages de cellules bactériennes, organisés et structurés, sont responsables de très nombreuses infections opportunistes essentiellement chroniques. Ainsi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Burkholderia cepacia sont trois espèces bactériennes isolées des poumons de patients atteints de mucoviscidose (MCV) capables de déployer un véritable arsenal de facteurs de virulence, en passant de la phase colonisation avec formation de biofilm à l’infection. En particulier, P. aeruginosa, une bactérie du groupe ESKAPE, a récemment été reclassé par l’Organisation Mondiale de la Santé, dans la liste des pathogènes critiques, pour lesquels de nouvelles solutions thérapeutiques sont nécessaires. Parmi ces nouvelles approches, l’inhibition de la formation du biofilm apparait prometteuse, en permettant notamment de conserver les cellules bactériennes dans un état planctonique, plus facilement éliminable par le système immunitaire ou par un traitement antibiotique. Dans ce contexte, le premier objectif de ce projet est d’identifier de nouvelles molécules capables d’inhiber le système de communication par Quorum Sensing de P. aeruginosa, basé sur la PQS (Pseudomonas Quinolone Signal). Parallèlement, et au regard de l’implication de biofilms multi-espèces dans les infections pulmonaires de patients atteints de MCV, notre deuxième objectif est d’évaluer l’impact de ces inhibiteurs sur la structuration globale d’un biofilm issu de consortia incluant P. aeruginosa. Dans un premier temps, une bibliothèque de composés, analogues structurels à la PQS, a été soumise à un screening virtuel par modélisation moléculaire, afin de prédire l’affinité de ces composés pour la protéine cible PqsR. Trois séries de composés ont été synthétisées : les chromones (série 1), chromones inverses (série 2) et les flavonoïdes (série 3) et ont été soumises à ce screening in silico. En parallèle, leur activité anti-biofilm a été évaluée in vitro. Les composés les plus actifs ont été sélectionnés en vue d’une évaluation sur biofilms multi-espèces. La deuxième partie du projet a ainsi porté sur la mise au point et la validation d’un modèle de biofilm multi-espèces, composé de trois espèces P. aeruginosa, S. aureus et B. cepacia. Le choix s’est porté sur des conditions de culture proches de celles décrites in vivo, notamment dans un milieu minimum. D’autre part, un intérêt particulier a été porté à l’étude de l’effet de la concentration en NaCl, puisque, in vivo, celle-ci augmente avec l’épaississement du mucus. Le suivi des populations adhérées a été réalisé par numération des UFC et par qPCR, associé à des observations en microscopie confocale. Un des résultats majeurs obtenu concerne l’effet positif d’une concentration élevée en NaCl sur la capacité de S. aureus à coexister au sein de biofilms structurés avec P. aeruginosa, malgré un antagonisme démontré dans la littérature et confirmé ici. Un effet bénéfique de NaCl a été également observé vis-à-vis des biofilms à P. aeruginosa. Au final, l’augmentation de la concentration de NaCl dans le microenvironnement des espèces bactériennes étudiées (S. aureus, P. aeruginosa et B. cepacia) permettrait d’expliquer les coinfections pulmonaires par P. aeruginosa et S. aureus, et secondairement par B. cepacia. Le modèle multi-espèce ainsi développé servira pour l’évaluation des analogues de PQS , sélectionnés pour leur capacité à inhiber la formation de biofilms mono-espèces à P. aeruginosa. Ils seront utilisés seuls ou associés à d’autres inhibiteurs précédemment synthétisés, afin de démontrer leur potentiel intérêt thérapeutique.Bacterial biofilms represent a major threat to global public health. Indeed, these organized and structured communities are responsible for a large number of opportunistic and chronic infections, essentially. In this context, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Burkholderia cepacia are three bacterial species isolated from the lungs of cystic fibrosis (CF) patients capable of deploying a veritable arsenal of virulence factors, from the colonization phase with biofilm formation to infection. Especially, P. aeruginosa, a bacterium belonging to the ESKAPE group, has recently been reclassified by the World Health Organization as a critical pathogen, for which new therapeutic solutions are required. Among these new approaches, the inhibition of biofilm formation appears promising, allowing to preserve bacterial cells in a planktonic state, more easily eliminated by the immune system or by an antibiotic treatment. In this context, the first objective of this project is to identify new molecules able to inhibit the Pseudomonas Quinolone Signal (PQS) -based Quorum Sensing communication system of P. aeruginosa. In parallel, because of the involvement of multi-species biofilms in pulmonary infections of patients with CF, our second objective is to evaluate the impact of these inhibitors on the global structure of P. aeruginosa containing biofilms. First, a virtual screening by molecular modeling was performed on a library of structural PQS-analogues, in order to predict the affinity of these molecules for the target PqsR protein. Three series of compounds were synthesized: chromones (series 1), inverse chromones (series 2) and flavonoids (series 3) were subjected to this in silico screening. In parallel, their anti-biofilm activity was evaluated out in vitro. Most active compounds were selected for evaluation on multi-species biofilms. The second part of the project concerned the development and validation of a multi-species biofilm model composed of three species P. aeruginosa, S. aureus and B. cepacia. The choice was made to use culture conditions close to those described in vivo, notably the use of a minimal medium. In addition, particular attention was paid to the effect of NaCl concentration, which increases in vivo with mucus thickening. Monitoring of adherent populations was performed by CFU counting and qPCR, associated with confocal microscopy observations. One of the major results obtained concerns the positive effect of a high concentration of NaCl on the ability of S. aureus to coexist within biofilms with P. aeruginosa, despite an antagonism previously demonstrated in the literature and confirmed in this work. A beneficial effect of NaCl was also observed towards P. aeruginosa biofilms. Finally, the increase of NaCl concentration in the microenvironment of the three studied bacterial species (S. aureus, P. aeruginosa et B. cepacia) would explain pulmonary co-infections by P. aeruginosa and S. aureus, and then, by B. cepacia. This developed multi-species model will be used for the evaluation of PQS analogs, chosen for their ability to inhibit the formation of one-species biofilms of P. aeruginosa. They will be used alone or associated with inhibitors previously synthesized, in order to demonstrate their potential therapeutic interest