Optimisation de la plateforme CHOZN® CHO K1 de génération de lignées cellulaires clonales pour la production de protéines recombinantes à usage thérapeutique

La production de protéines recombinantes thérapeutiques est une évolution majeure, qui a permis de répondre aux limitations de la production par des sources naturelles et de développer de nouveaux médicaments. Les anticorps monoclonaux dominent désormais le marché des protéines recombinantes à application thérapeutique. La génération d’une lignée cellulaire est la première étape du développement du procédé de production d’une protéine recombinante à usage thérapeutique. Cette étape, décisive à de nombreux points de vue, assure le développement d’une lignée cellulaire clonale, productrice de la protéine recombinante et stable.Une plateforme de génération de lignées cellulaires est composée d’une lignée hôte, d’un vecteur d’expression et d’un procédé de génération de lignée. La thèse a pour objectif de comprendre les paramètres critiques pour l’expression de protéines recombinantes en cellules CHO (Chinese Hamster Ovary), du point de vue de chacun des éléments de la plateforme. Ces travaux ont directement été mis en application dans un contexte industriel. En effet, ils visent à optimiser la plateforme CHOZN® CHO K1, proposée dans le cadre des activités de CDMO (Contract Development and Manufacturing Organization) de Merck, afin d’augmenter la productivité des lignées générées et de réduire les délais de développement.Les caractéristiques et la performance de la plateforme de génération de lignée cellulaires CHOZN® CHO K1 ont d’abord été définies au cours d’un procédé basé sur une génération de mini-pools et une génération de clones. Cette caractérisation initiale, ayant conduit à l’obtention en 7,5 mois de clones produisant plus de 1 g/L d’un anticorps monoclonal standard, a permis d’identifier deux axes de travaux de recherche : l’optimisation du procédé de génération de lignées cellulaires clonales pour la diminution des délais de développement de lignées, et l’optimisation du vecteur d’expression, pour l’augmentation de la productivité des lignées générées.Un procédé de génération de lignées accéléré, appelé clonage direct, a été évalué. Ce procédé a permis de réduire de près de moitié la durée du procédé de développement de lignées, mais a, en revanche, conduit à la diminution de la productivité des lignées générées.Par ailleurs, plusieurs promoteurs atténués ont été évalués pour l’expression de la résistance à la pression de sélection, indispensable pour la génération de clones stables et producteurs. Certains promoteurs, utilisés lors d’un procédé de génération de lignées basé sur le clonage direct précédemment évalué, ont conduit à l’obtention en 4 mois de clones produisant plus de 3 g/L d’un anticorps monoclonal standard. De façon générale, l’utilisation de ces promoteurs a conduit à l’augmentation de la productivité des lignées générées. L’augmentation de la productivité des lignées a été confirmée sur plusieurs anticorps monoclonaux et une protéine de fusion Fc.Ces travaux ont donc permis d’augmenter la productivité des lignées recombinantes, et de diminuer les délais de développement de ces lignées. Ces enjeux sont cruciaux, dans un contexte où le processus de mise sur le marché d’une molécule thérapeutique est très concurrentiel.Production of therapeutic recombinant proteins is a major development, which has made possible to respond to the limitations of production by natural sources and to develop new drugs. Monoclonal antibodies now dominate the market for recombinant proteins for therapeutic applications. The generation of a cell line is the first step in the development of a recombinant protein production process for therapeutic use. This step, which is decisive from many points of view, ensures the development of a stable clonal cell line that produces the recombinant protein.A cell line generation platform is composed of a host cell line, an expression vector and a cell line generation process. The objective of this thesis was to understand the critical parameters for the expression of recombinant proteins in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, from the point of view of each of the platform components. This work was directly applied in an industrial context. Indeed, this work aims at optimizing the CHOZN® CHO K1 platform, proposed within the framework of Merck's CDMO (Contract Development and Manufacturing Organization) activities, in order to increase productivity of recombinant cell lines and to reduce the development timelines.The characteristics and performance of the CHOZN® CHO K1 cell line generation platform were first defined in a process based on a mini-pool generation and a clone generation. This initial characterization, which led to the production of clones producing more than 1 g/L of a standard monoclonal antibody in 7.5 months, led to the identification of two areas of research: optimization of the clonal cell line generation process to reduce cell line development times, and optimization of the expression vector to increase the productivity of generated cell lines.An accelerated cell line development process, called direct single-cell cloning, was evaluated. This process reduced the duration of the line development process by almost half, but led to a decrease in the productivity of the generated cell lines.In addition, several attenuated promoters were evaluated for the expression of resistance to selection pressure, essential for the generation of stable and producing clones. Some promoters, used in a cell line generation process based on direct single-cell cloning previously evaluated, led to the identification in 4 months of clones producing more than 3 g/L of a standard monoclonal antibody. In general, the use of these promoters led to an increase of productivity of generated cell lines. This productivity increase was confirmed on several monoclonal antibodies and an Fc fusion protein.This work has thus made it possible to increase the productivity of recombinant cell lines and to reduce cell line development timelines. These issues are crucial in a context where the process of bringing a therapeutic molecule to the market is highly competitive