Formation of blood platelets : mechanisms involved in megakaryocytes intravasation across medullar sinusoids

Les plaquettes sanguines sont vitales pour la prévention des hémorragies. Une étape clé et encore mal comprise dans leur formation est le passage de leurs précurseurs, les mégacaryocytes (MK) au travers de la barrière endothéliale des sinusoïdes médullaires, permettant de libérer des fragments cytoplasmiques dans le sang, lesquels se remodèleront ensuite en plaquettes dans la circulation. L’objectif de cette thèse a été de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’intravasation des MKs.Dans la première partie, j’ai montré que les protrusions émises in situ par les MKs au contact des sinusoïdes sont des podosomes. Les podosomes s’invaginent profondément dans l’endothélium jusqu’à le traverser, permettant aux MKs d’emprunter une voie transcellulaire vers la circulation. Ils sont reliés par un réseau secondaire d’actomyosine, adoptant ainsi une organisation collective, interconnectée, permettant aux MKs de perforer l’endothélium en de multiples points. Le rôle essentiel du cytosquelette d’actomyosine dans la structuration des podosomes in vivo, a pu être confirmé en analysant l’impact des déficits en complexe Arp2/3 ou en myosine IIA dans la lignée mégacaryocytaire. Dans la deuxième partie de la thèse, nous nous sommes intéréssés au rôle des intégrines dans l’intravasation des MKs par l’utilisation de souris déficientes en intégrines β1 et β3. L’observation de la moelle de ces souris a mis en lumière le rôle essentiel des intégrines dans la prévention du passage de MKs entiers au travers des sinusoïdes. Les intégrines contrôlent l’intravasation des MKs en permettant leur ancrage dans la matrice extracellulaire et en modulant les propriétés physiques et structurales de leurs noyaux. Enfin, dans la troisième partie de la thèse, nous avons évalué la contribution des métalloprotéases dans ce processus. L’étude de la moelle osseuse de souris déficientes en MT1-MMP, nous a permis de démontrer que cette enzyme n’était pas nécessaire dans la formation des podosomes et au passage de la lame basale. Plus globalement, nos données révèlent que les MKs matures issus de la moelle n’ont pas d’activité de dégradation de la matrice et que l’activité des MMPs n’est pas nécessaire dans la formation des plaquettes in vivo.L'ensemble de nos résultats permet une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l'intravasation des MKs en identifiant l'un de ses principaux acteurs : le podosome. De nombreux types cellulaires forment ces structures d’adhésion particulières. Ce travail ouvre ainsi des perspectives plus larges en Biologie Cellulaire. Il amène des pistes pour explorer les mécanismes d’intravasation des autres cellules sanguines en générale ou dans un contexte plus pathologique de cellules tumorales.Blood platelets are vital for the prevention of bleeding. A key and still poorly understood step in their formation is the passage of their precursors, megakaryocytes (MKs), through the endothelial barrier of the medullary sinusoids, to release cytoplasmic fragments into the blood, which will remodel into platelets. The aim of the present thesis is to understand the cellular and molecular mechanisms involved in the intravasation of MKs. In the first part, I characterized the invasive protrusions emitted in situ by MKs at the sinusoidal contact. These protrusions can invaginate deep into the endothelium until they cross it, leading MKs to take a transcellular route to the circulation. These structures, connected by a lateral actomyosin network, adopt a collective, interconnected organization, allowing MKs to perforate the endothelium at multiple points. The essential role of the actomyosin cytoskeleton in the in vivo organization of podosomes has been confirmed by analyzing the impact of Arp2/3 complex or myosin IIA deficiency in the megakaryocytic lineage. In the second part of the thesis, we focused on the role of integrins in MKs intravasation by using 1 and 3 integrin deficient mice, demonstrating that they prevent the passage of whole MKs through the sinusoids. Integrins control MKs intravasation by mediating their anchoring in the extracellular matrix and by modulating the physical and structural properties of their nuclei. Finally, in the third part of the thesis, we evaluated the contribution of metalloproteinases in the process of MKs intravasation. By investigating the bone marrow of MT1-MMP deficient mice, we demonstrated that this enzyme was not required for podosome formation and basement membrane passage. More generally, our data reveal that mature MKs from marrow do not have matrix degradation activity and that MMP activity is not required for platelet formation in vivo.Our work has improved our understanding of a key step in thrombopoiesis, the transmigration of MKs through the sinusoids of the bone marrow. Many cell types elaborate these structures, including invasive cancer cells, macrophages and osteoclasts. This work therefore offers wider perspectives in cell biology. It provides insights into the mechanisms of intravasation of other blood cells as well as in a more pathological context of tumor cells