Identification des bases génétiques du mélanome de l'enfant

En France, le cancer est la première cause de décès par maladie chez l'enfant. Chaque année, 2500 enfants et adolescents se voient diagnostiquer un cancer, dont la moitié chez les enfants de moins de cinq ans et 700 chez les jeunes de 15 à 18 ans. Le pronostic des cancers pédiatriques est souvent mauvais, avec des conséquences dévastatrices. Cependant, les tumeurs malignes détectées chez les enfants et les adolescents ne sont pas de la même nature que celles des adultes et ne peuvent donc pas être comprises et traitées de la même manière. Comparé au mélanome de l'adulte, le mélanome pédiatrique est une maladie rare qui représente moins de 1 % de tous les diagnostics de mélanome. De plus, la plupart des cas pédiatriques sont sporadiques et surviennent parfois au sein de naevus congénitaux géants, ce qui favorise l'hypothèse de mutations de novo. Notre hypothèse est que les "accidents" génétiques de novo se produisent soit dans un gamète parental, soit post zygotiquement pendant le développement de l'embryon. Pour tester cette hypothèse, nous avons séquencé des exomes constitutionnels sur de l'ADN extrait du sang d'enfants atteints de mélanome et de leurs parents sains (trios) et de 6 tumeurs de mélanome congelées. Nous avons identifié des mutations germinales ou post-zygotiques de novo dans 14 gènes impliqués dans le développement de la crête neurale, du mélanome ou du cancer. Mon projet de thèse vise à étudier le rôle biologique inconnu de gènes candidats de novo au cours du développement des lignées NC et mélanocytaires. Nous avons effectué une analyse fonctionnelle des gènes candidats de novo FBXO32, SOX10, DSCAM et ALDH1L1. Pour répondre à ce défi, les modèles transgéniques conventionnels ne sont pas entièrement adaptés, nous avons donc conçu des modèles originaux in vivo, ex vivo et in vitro pour éclairer la signification biologique de ces variantes. Dans le NC céphalique, nos résultats montrent que les quatre gènes candidats, lorsqu'ils sont désactivés, altèrent la prolifération et la différenciation des mélanocytes de manière différente, suggérant que ces gènes exercent des rôles dans la biologie normale des mélanocytes. Ensuite, nous nous sommes concentrés sur le gène FBXO32 dans lequel une mutation germinale de novo, p.G139S, a été identifiée chez un enfant de sept ans présentant un mélanome de niveau III. Nos résultats montrent que l'inactivation de FBXO32 altère la prolifération, la différenciation et la vascularisation des mélanocytes dans le tronc NC. Pour étudier l'expression de la spécificité endogène de FBXO32, nous avons réalisé des expériences de sauvetage par coélectroporation de dsFBXO32 avec la forme humaine sauvage ou mutée de FBXO32. Alors que le sauvetage de FBXO32 est capable de compenser l'extinction du gène endogène et de restaurer la différenciation normale des mélanocytes, l'ADNc mutant, FBXO32G139S, a un effet néfaste sur la lignée mélanocytaire. Afin de décrypter le rôle de FBXO32 dans la lignée mélanoblastique dans la NC céphalique, nous avons mis en place un modèle d'explant de peau 3D in vitro, qui nous a permis de suivre la différenciation des appendices cutanés et de caractériser la différenciation normale des mélanocytes dans l'épiderme, et/ou leur migration aberrante vers le derme. Plus précisément, FBXO32 induit la prolifération des mélanocytes, associée à la migration des mélanocytes vers le derme. Au niveau cellulaire, FBXO32 déclenche la transformation des mélanocytes et le remodelage du cytosquelette. Nous montrons ainsi que FBXO32 entrave l'adhésion focale et l'organisation des filaments d'actine, suggérant l'implication de ce mécanisme dans les processus d'invasion. Grâce au profilage transcriptionnel, nous avons constaté que FBXO32 orchestre un enrichissement différent des gènes au niveau de la CN du tronc et de la CN crânienne. Nos résultats montrent que FBXO32 pourrait être un gène crucial dans le développement des mélanocytes et potentiellement impliqué dans la mélanomagenèse.In France, cancer is the leading cause of death by disease in children. Every year, 2500 children and adolescents are diagnosed with cancer, half of them in children under five years old and 700 in young people between 15 and 18 years old. The prognosis of pediatric cancers is often poor, with devastating consequences. However, oncology research mainly focuses on understanding the cancer mechanisms in adults. However, malignant tumors detected in children and adolescents are not of the same nature as those of adults and, therefore cannot be understood and treated in the same way. Compared to adult melanoma, pediatric melanoma is a rare disease accounting for less than 1% of all melanoma diagnoses. Furthermore, most pediatric cases are sporadic and sometimes arise within giant congenital nevi, favoring the hypothesis of de novo mutations. Our hypothesis is that de novo genetic “accidents” occur either in a parental gamete or post zygotically during embryo development. To test this hypothesis, we sequenced constitutional exomes on DNA extracted from the blood children with melanoma and their healthy parents (trios) and 6 frozen melanoma tumors. We identified de novo germline or post-zygotic mutations in 14 genes involved in the development of the neural crest, melanoma, or cancer. My thesis project aims to study the unknown biological role of de novo candidate genes during the development of NC and melanocyte lineages. We performed functional analysis of FBXO32, SOX10, DSCAM, and ALDH1L1 de novo candidate genes. To address this challenge, the conventional transgenic models are not fully suitable, so we designed original in vivo, ex vivo, and in vitro models to enlighten the biological significance of these variants. In the cephalic NC, our results show that the four candidate genes, when knocked down, impair melanocyte proliferation and differentiation in a different way, suggesting these genes exert roles in the normal biology of the melanocytes. Then, we focused on the FBXO32 gene in which de novo germline mutation, p.G139S, was identified in a seven-year-old child with melanoma level III. Our results show that the silencing of FBXO32 impairs melanocyte proliferation, differentiation, and vascularization in the trunk NC. Then, we performed rescue experiments by co-transfecting the human wild-type or mutated form of FBXO32. While the rescue of FBXO32 is able to compensate for the silencing of the endogenous gene and restore normal melanocyte differentiation, the mutant cDNA, FBXO32G139S, has a detrimental effect on the melanocyte lineage. To decipher the role of FBXO32 in the melanoblast lineage in the cephalic NC, we set up an in vitro 3D skin explant model, which allowed us to follow the differentiation of skin appendages and to characterize the normal differentiation of melanocytes in the epidermis, and/or their aberrant migration to the dermis. Specifically, FBXO32 induces melanocyte proliferation, associated with melanocyte migration towards the dermis. At the cellular level, FBXO32 triggers melanocyte transformation and cytoskeleton remodeling. At a subcellular level, we show that FBXO32 hinders focal adhesion and actin filaments organization suggesting the involvement of this mechanism in invasion processes. Through transcriptional profiling, we found that FBXO32 orchestrates different gene enrichment at the trunk NC and cranial NC. Our data show that FBXO32 could be a crucial gene in melanocyte development and potentially involve melanomagenesis