Enzymes chimériques pour la catalyse énantiosélective de réactions en cascade

Dans le cadre de la recherche de procédés chimiques plus respectueux de l'environnement, les enzymes artificielles constituent des catalyseurs de choix pour la synthèse de produits d'intérêt pour la chimie fine dans des conditions éco-compatibles (P, T, H₂O). En s'inspirant des réactions enzymatiques multiples, naturelles et artificielles, l'objectif de ce projet était de préparer une enzyme chimérique possédant deux sites actifs, par fusion des domaines catalytiques de deux enzymes apparentées de la super-famille des Cupines : La Pirin Like Protein (PLP) et la Mannose-6-Phosphate Isomérase (PMI). Ces deux bicupines sont constituées de deux domaines composés chacun d'un tonneau de quatre feuillets β, qui sont reliés par un seul inter-domaine composé d'hélices α. Nous avons édité les vecteurs codant pour les protéines ciblées HIS₆ taguées en y introduisant le site de clivage de la protéase TEV. PMI et PLP ont pu être exprimées et purifiées. Après l'extraction de leurs cations métalliques natifs par de l'EDTA, leur transformation en de nouvelles métalloprotéines artificielles par fixation de cuivre(II) a été réussie et Cu-PMI et Cu-PLP ont pu être caractérisées par ITC, RPE et Fluorescence. L'enzyme chimérique combinant les domaines catalytiques de la PMI et de la PLP a ensuite pu être préparée. La stratégie suivie a commencé par des études de modélisation structurale permettant d'identifier le site de fusion adéquat des deux domaines. Ensuite, le vecteur d'expression codant pour la chimère a été construit puis la chimère a été exprimée dans E.coli BL21. Cependant, une optimisation de la purification reste à faire. Les perspectives de l'utilisation de l'enzyme chimérique PMI-PLP résident dans la catalyse eco-compatible de réactions en cascade avec une économie d'atome.In the context of ecofriendly chemistry, artificial enzymes are promising catalysts that should enable the synthesis of fine chemicals. Inspired by natural and artificial enzymatic catalysis, we aimed to prepare an artificial chimeric enzyme that possesses two active sites by the fusion of catalytic domains of two related enzymes that belong to the cupin superfamily of proteins. Pirin Like Protein (PLP) and Mannose-6-Phosphate Isomerase (PMI) are similar bicupins characterized by a structure formed of two beta barrel domains. In this project, the vectors encoding for PMI and PLP comprising a HIS₆ tag were edited by introducing a TEV protease cleavage site. PMI and PLP proteins have been successfully expressed and purified. After removal of their native metal cations by EDTA, their transformation into a copper metalloprotein was successful. Cu-PMI and Cu-PLP were characterized by ITC, EPR and Fluorescence. Then, the chimeric enzyme was designed by combining the catalytic domains of PMI and PLP. The strategy we followed to prepare the PMI-PLP bicupin chimera started first by structural modeling studies that allowed us to identify the most favorable site for the fusion of the two domains. Then, the expression vector containing the DNA encoding for the PMI-PLP chimera was constructed, and the chimera was successfully expressed in E.coli BL21 cells. However, an optimization of the purification remains to be done. As perspectives, the chimeric PMI-PLP enzyme would be used to catalyze reactions in cascade with maximized atom economy under ecofriendly conditions