Characterization of a novel antibody targeting tumor-associated macrophages

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) sont une des principales populations cellulaires du microenvironnement tumoral. Ils favorisent la croissance et les métastases tumorales et confèrent aux cellules cancéreuses une résistance à l'apoptose, aux attaques du système immunitaire et à la thérapie. Le ciblage thérapeutique des TAM dans les cancers reste difficile, en raison de leur grande plasticité et de l'absence de marqueurs exclusifs. L'équipe 9 du CRCT a alors développé un anticorps monoclonal appelé 6-25, en utilisant des cellules de type Nurse-like (NLC) comme modèle de TAM. Les NLC sont le type de TAM rencontrés dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC), sont cruciales pour la survie des cellules leucémiques et peuvent être facilement générées in vitro. L'anticorps 6-25 a été caractérisé pour se lier spécifiquement aux TAM de différentes tumeurs en reconnaissant la protéine sidéroflexine-3 (SFXN3) à leur surface. L'anticorps 6-25 et sa cible ont été brevetés (WO2018/020000 et WO2018/19990). L'objectif global de cette thèse était de caractériser davantage la spécificité et le potentiel thérapeutique de l'anticorps 6-25 ainsi que le rôle biologique de sa cible, la SFXN3. La première partie de la thèse visait à évaluer la fonctionnalité de l'anticorps 6-25. La version IgG1 nue de l'anticorps 6-25 n'a montré aucune toxicité envers les PBMC provenant à la fois de donneurs sains et de patients atteints de LLC. Il n'a pas causé de déplétion des NLC et n'a montré qu'un effet mineur sur le phénotype de ces cellules et des macrophages dérivés des monocytes (MDM) in vitro. Cependant, l'anticorps 6 25 s'est avéré être efficacement internalisé par les NLC. La deuxième partie de la thèse a été consacrée à la cible proposée reconnue par l'anticorps 6-25, la SFXN3. En raison du manque général d'informations concernant SFXN3, la caractérisation plus approfondie de son expression dans les macrophages a été étudiée. De nombreuses expériences sur MDM traitées avec divers agents polarisants M1 et M2, ont prouvé que la cible du 6 25 est spécifiquement exprimée à la surface des macrophages de type M2. Les résultats obtenus lors du criblage de la cible 6-25 sur MDM ont en outre été utilisés pour étudier son modèle d'expression dans la NLC. L'augmentation de l'expression de la cible du 6-25 à la surface des NLC a été corrélée à leurs fonctions protectrices, ce qui en fait un marqueur de TAM protumoraux. De plus, des expériences sur la polarisation des NLC ont permis de mieux comprendre le rôle du TNF et de l'IL-10 sur la biologie de ces cellules et en particulier la fonction protectrice vis-à-vis des cellules cancéreuses LLC. La réalisation des expériences complémentaires sur la cible reconnue par l'anticorps 6 25 a conduit à la remise en cause initiale et finalement à la disqualification de la SFXN3 en tant qu'épitope potentiel. La ré-identification ultérieure de la cible a été effectuée à l'aide d'une immunoprécipitation optimisée/spectrométrie de masse quantitative (IP-MS) et d'une approche RNAseq, qui a fourni la liste des cibles potentielles. Dans le processus de criblage, le récepteur du folate ß (FRß) a été identifié comme la cible de l'anticorps 6-25. Les résultats présentés dans cette thèse montrent que l'anticorps 6-25 représente une voie prometteuse pour cibler les TAM. Le FRß a été montré comme étant un marqueur M2 spécifique des TAM. [...]Tumor-associated macrophages (TAM) belong to the major cell population of tumor microenvironment where they support tumor growth and metastasis, and also confer cancer cells resistance to apoptosis, immune system attacks and therapy. Therapeutic targeting of TAM in cancer remains challenging, owing to their high plasticity and lack of exclusive markers. To address these problems, Team 9 of CRCT developed the monoclonal antibody called 6-25, using Nurse-like cells (NLCs) as the model of TAM. NLCs are the type of TAM encountered in chronic lymphocytic leukemia (CLL), are crucial for the survival of cancer B-CLL cells and can be easily generated in vitro. The 6-25 antibody has been further characterized to specifically bind to TAM of different human malignancies by recognizing sideroflexin-3 (SFXN3) protein on their surface. Both 6-25 antibody and its target have been patented (WO2018/020000 and WO2018/19990). The overall aim of this thesis was to further characterize specificity and therapeutic potential of 6-25 antibody and also biological role of its target - SFXN3. The first part of the thesis aimed to evaluate the functionality of the 6-25 antibody. Naked, IgG1 version of 6-25 antibody showed no toxicity toward PBMC from both healthy donor and CLL patients. It did not cause depletion of NLCs and showed only minor effect on the phenotype of monocyte-derived macrophages (MDM) in vitro. On the other hand, 6 25 antibody turned out to be efficiently internalized by NLCs. The second part of the thesis was dedicated to the proposed target recognized by 6-25 antibody - SFXN3. Because of overall lack of information regarding SFXN3, the more in-depth characterization of its expression in macrophages have been studied. Numerous experiments on MDM treated with various M1 and M2 polarizing agents, proved that 6 25 target is specifically expressed on the surface of M2-like macrophages and its level could be abolished after administration of TNF and to lesser extent with IFN-ƴ and LPS. Results obtained during screening of 6-25 target on MDM were further used to study its expression pattern in NLC. Upregulation of 6-25 target on the surface of NLCs was consistently correlated with their protective functions, making it a marker of protumoral-TAM. Additionally, experiments on NLC polarization led to gaining an insight into the role of TNF and IL-10 on the biology of these cells and in particular the protective function toward cancer CLL cells. Performing the additional experiments on the target recognized by 6-25 antibody, led to initially question and finally disqualification of SFXN3 as the potential epitope. Subsequent target re-identification was done using optimized immunoprecipitation/quantitative mass spectrometry (IP-MS) and RNAseq approach, which provided the list of potential antibody targets. In the process of screening, folate receptor ß (FRß) was identified as the target of 6-25 antibody. This result was successfully validated by: 1 - knock-out (KO) of FRß gene (FOLR2) in primary macrophages, and 2 - overexpression of FOLR2 in HEK-T cells (wild type HEK-T cells do not express 6-25 target). Results presented in this thesis show that the 6-25 antibody represents a promising way of targeting TAM. They also fully support FRß, as a specific M2 marker of TAM. Because of functional properties of 6 25, including high specificity and internalization upon binding to M2-like macrophages, antibody-drug conjugate (ADC) version of it have been generated. As initial experiments with 6-25 ADC showed promising results in depletion of macrophages expressing FRß, they will be continued in the future. Also in perspective, the in vivo experiments with 6-25 antibody are planned to evaluate its efficacy in modulating tumor microenvironment (TME), in order to improve the outcomes of anticancer therapy