Stabilisierte und in ihrer Selektivität modifizierte Proteasen - Immobilisierung durch Copolymerisation von Enzymen

Die als VIP-Technik bezeichnete Methode stellt ein Verfahren zur Aufrechterhaltung imprinteter Proteinkonformationen dar. Die Technik beinhaltet die Weiterentwicklung einer kovalenten Zwei-Schritt-Immobilisierungsmethode, bei der Enzyme zunächst mit copolymerisierbaren Doppelbindungen enthaltenden Gruppen derivatisiert werden. Eine anschließende Copolymerisation mit einem Crosslinker überführt die Enzymderivate in Immobilisate. Die erzielbare Stabilitätsverbesserung wurde an Hand der enzymatischen Glycosylierung von Chloramphenicol mit der ß-Glucosidase aus der Mandel aufgezeigt. Die Induzierung einer Akzeptanz gegenüber D-konfigurierte Substrate wurde am Beispiel alpha-Chymotrypsin und Subtilisin Carlsberg durch eine Fällung mit 1-Propanol in Gegenwart ihres kompetitiven Inhibitors N-Acetyl-D-tryptophan realisiert. Die resultierenden Enzympräparationen waren in der Lage, N-Acetyl-D-tryptophanethylester aus N-Acetyl-D-tryptophan und Ethanol in Cyclohexan zu synthetisieren. Eine vor dem Imprinting durchgeführte Derivatisierung der Enzyme mit Itaconsäureanhydrid ermöglichte die Copolymerisation der in Cyclohexan suspendierten Enzympartikel. Die imprintete D-Akzeptanz wurde dadurch so fixiert, daß im wässrigen Medium der D-konfigurierte Ester enzymatisch hydrolysiert werden konnte. Die hergestellten VIPs (vernetzte imprintete Proteine) wurden detailliert charakterisiert.The VIP technique is a procedure for the maintenance of imprinted protein conformations. The technique is the development of a covalent two-step immobilization method, in which at first enzymes are derivatized with copolymerizable doublebonds containing groups. A following copolymerization with a crosslinker converts the enzyme derivatives into immobilizates. The achievable improvement on enzyme stability was monitored following the enzymatic glycosylation of chloramphenicol with the ß-glucosidase from almond. The induction of an acceptance for D-configurated substrates was realized with alpha-chymotrypsin and subtilisin Carlsberg by precipitating them with 1-propanol in the presence of their competitive inhibitor N-acetyl-D-tryptophan. The resulting enzyme preparations were able to synthesize N-acetyl-D-tryptophan ethyl ester from N-acetyl-D-tryptophan and ethanol in cyclohexane. The derivatization of these enzymes with itaconic anhydride prior to the imprinting step allowed the copolymerization of the enzyme particles which were suspended in cyclohexane. By this, the imprinted D-acceptance was fixated in the way that the D-configurated ester could be hydrolyzed enzymatically. The VIPs (crosslinked imprinted proteins) were characterized in detail