The role of the signaling mediator Smad1 in BMP2-dependent osteo/chondrogenic development in mesenchymal progenitors (C3H10T1/2)

The aim of this research was to elucidate the functions of the three domains of the BMP2 signaling mediator-Smad1: the N-terminal domain, the C-terminal domain and the proline-rich linker domain, especially the function of the less conserved proline-rich linker region, in the mesenchymal differentiation processes, particularly in regard to osteo-/chondrogenic development was investigated by histological staining and also by RT-PCR analyses of the expression of several marker genes, which are specific or typical for osteogenic-, chondrogenic-, and adipogenic development. Smad1 and its biological active C domain initiated osteogenic development in the C3H10T1/2 cells and stimulated in C3H10T1/2BMP2 cells differentiation into osteogenic lineages. The N domain was sufficient to initiate transcription of some osteogenic marker genes in parental C3H10T1/2 cells. However, this domain blocked osteogenic development when recombinantly expressed in C3H10T1/2BMP2 cells. The P domain dominant-negatively inhibited the BMP2-dependent osteogenesis in C3H10T1/2 cells. The P domain of Smad1 inhibited Smad1 C domain dependent osteogenesis in a dose dependent manner. And the inhibitory effect of P domain on osteogenesis is not a common property of all Smads, but seems specific for Smad1. Smad1 and its domains do obviously not participate in the BMP2-dependent chondrogenic development. The trancriptional assays of promoter luciferase constructs for some BMP-responsive genes, substantiated the histological and genetic analyses of Smad1 by showing stimulation of the promoter luciferase activities by the Smad1 C domain. The analysis of effects of the Smad1 domains has important value in understanding the process of BMP2-dependent osteo-/chondrogenic development in mesenchymal progenitors (C3H10T1/2).Die vorliegende Forschung zielt darauf ab, die Funktionen der drei Domänen des BMP2-Signalmediators Smad1, insbesondere die Funktion der weniger konservierten Linkerdomäne in dem mesenchymalen Differentierungsprozeß zu ermitteln. Vor allem werden ihre Funktionen in bezug auf die osteo-/chondrogene Entwicklung mittels histologischer Färbung und genetischer Anaylse der Expression mehrerer Markergene, die spezifisch oder typisch für die osteogene, chondrogene und adipogene Entwicklung sind, untersucht. Smad1 und sein biologisch aktive C-Domäne führen osteogene Entwicklung in C3H10T1/2 -Zellen ein und stimulieren die Differenterung von C3H10T1/2BMP2-Zellen zur osteogenetischen Zellinie. Die N-Domäne ist in der Lage, die Transkription von manchen osteogenetischen Markergenen in der C3H10T1/2-Zellen zu induzieren, während sie die osteogenetische Entwicklung der rekombinanten C3H10T1/2BMP hindert. Die Linkerdomäne inhibiert die BMP2-abhängige Osteogenese auf dominant negative Weise. Die von Smad1 C-Domäne abhänige Osteogenese wird je nach der Dosis der Smad1 P-Domäne mehr oder weniger gehindert. Die Inhibierung der Osteogenese durch die P-Domäne ist aber nur auf Smad1 beschränkt. Smad1 und ihre Domäne zeigen keine Auswirkung auf die BMP2-abhänige chondrogene Entwicklung. Die Transkriptionsanalyse der Promotor-Luciferase-Konstrukte der BMP-reagierten Gene bestätigt die Ergebnisse der histologischen Färbung und genetischen Analyse. Die Analyse der Auswirkung der Smad1-Domäne hat eine große Bedeutung für das Verständnis des Prozesses der BMP-abhängigen osteog-/chondrogene Entwicklung in den mesenchymalen Vorläuferzellen (C3H10T1/2)