Röntgenstrukturanalyse der Tyrosin-Aminotransferase aus Trypanosoma cruzi bei 2.5 Å Auflösung

Tyrosin-Aminotransferase (TAT) aus Trypanosoma cruzi ist ein mögliches Zielmolekül zur Entwicklung neuer Medikamente gegen die Amerikanische Trypanomiasis. Das Protein gehört zur strukturell bisher unbeschriebenen Aminotransferasen-Subfamilie I gamma und ist mit der menschlichen TAT zu 41 identisch. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Röntgenstrukturanalyse von T. cruzi-TAT, gibt ein Modell für das Substratspektrum des Enzyms und liefert einen strukturellen Vergleich mit anderen Aminotransferasen. Außerdem wird der Effekt von Punktmutationen, die beim Menschen zu vererbter TAT-Defizienz führen, erklärt sowie nach Gründen für die leicht unterschiedliche Spezifität des humanen Proteins gesucht. TAT aus T. cruzi-Epimastigoten wurde mit PEG 4000 bzw. 8000 als Fällungsmittel kristallisiert. Die Kristalle gehören zur Raumgruppe P 21 mit einem Dimer pro asymmetrischer Einheit und streuen an der Kupfer-Drehanode bis 2.5 A. Inititiale Phasen wurden aus der geschlossenen Form von E. coli-Aspartat-Aminotransferase gewonnen. Die endverfeinerte Struktur zeigt einen R-Wert von 15.7 (freier R-Wert: 21.4 ) und besitzt mit dem Suchmodell 13 Sequenzidentität. Das bevorzugte Substrat Tyrosin kann laut Computersimulation mit seiner Seitenkette eine Wasserstoffbrücke zu Asparagin 17 des Proteins ausbilden. Die Bevorzugung von Pyruvat vor zweifach negativ geladenen Oxoverbindungen beruht auf dem Kofaktorbindungsmodus in T. cruzi-TAT, der zu einer Abstoßung negativ geladener Substratseitenketten führt. In humaner TAT könnte die Anwesenheit eines Cysteins anstelle eines Glycins die Kofaktorbindung verändern, so daß die Abstoßungsmechanismen aus T. cruzi-TAT bei diesem Enzym nicht bestehen.Tyrosine aminotransferase (TAT) from Trypanosoma cruzi is a potential target for the developement of new drugs against American Trypanosomiasis. The protein belongs to the structurally uncharacterised aminotransferase subfamily I gamma and possesses a sequence identity of 41 with human TAT. This thesis describes the X-ray structure analysis of T. cruzi-TAT, gives a model for the enzyme's substrate spectrum and compares the protein with other aminotransferases on a structural basis. In addition, the effect of point mutations that lead to inherited TAT deficiency in man is explained and probable reasons for the slightly different substrate specificity of the human enzyme are presented. TAT from T. cruzi epimastigotes has been crystallised with PEG 4000 or 8000 as precipitant. Crystals belong to space group P 21 with one dimer per asymmetric unit and diffract to 2.5 A at a rotating copper anode. Initial phases could be obtained with the closed form of E. coli aspartate aminotransferase. The refined structure has an R-value of 15.7 (free R-value: 21.4 ) and exhibits 13 sequence identity with the search model. Computer simulations suggest the presence of a hydrogen bond between the side chain of the preferred substrate tyrosine and asparagine 17 of the protein. The preference for pyruvate over doubly negative charged oxocompounds is a consequence of the cofactor binding mode which leads to a repulsion of negatively charged side chains. In human TAT the presence of a cysteine instead of a glycine could change the cofactor binding such that the repulsion mechanism of T. cruzi-TAT does not exist in this enzyme