Charakterisierung und gezielte Optimierung des primären Energiestoffwechsels von kontinuierlichen Zelllinien zur Produktion rekombinanter pharmazeutischer Proteine

Kontinuierliche Säugetierzelllinien werden zur Produktion rekombinanter, pharmazeutisch nutzbarer Proteine verwendet, da sie in der Lage sind, post-translationale Modifikationen am Protein auszuführen und dieses nativ zu sekretieren. Jedoch weisen diese Zellen einen ineffektiven Energiestoffwechsel auf, da ihnen die enzymatische Verbindung zwischen Glycolyse und Citratzyklus fehlt. Als Folge dessen werden Lactat und Ammonium in den Kulturüberstand sekretiert, welche das Zellwachstum und die Produktivität beeinträchtigen. Zur Optimierung des Energiemetabolismus wurde die cytosolische Pyruvat-Carboxylase 2 (PYC2) aus Saccharomyces cerevisiae in der derzeit wichtigsten industriell genutzten Produktionszelllinie CHO DG44 exprimiert und ihr Einfluss auf den Energiestoffwechsel und die Produktivität untersucht. Durch Nachweis der Enzymaktivität wurde die erfolgreiche Expression rekombinanter PYC2 gezeigt. Entgegen Untersuchungen bei anderen Zelllinien hatte diese Möglichkeit der verbesserten Glucose-Oxidation keinen signifikanten Einfluss auf das vitale Wachstumsverhalten der bereits durch Selektion in der Industrie optimierten Zellen. Um festzustellen, ob dennoch eine Erhöhung der Produktivität der Zelllinie CHO DG44 mit diesem Schritt des Inversen Metabolic Engineering möglich war, wurde ein bicistronisches Plasmid konstruiert, das die Gene für das Modellprotein Human Growth Hormone (HGH) und die PYC2 enthält. CHO DG44 wurde mit diesem Plasmid und dem Dihydrofolat-Reductase-Gen cotransfiziert und die HGH- und PYC2-codierenden Gene wurden coamplifiziert. Jedoch konnten mit dieser Strategie weder der Energiemetabolismus noch die HGH-Produktivität dieser Zelllinie optimiert werden.Continuous mammalian cell lines are used for the production of recombinant pharmaceutical proteins as they are able to carry out post-translational modifications at the native secreted protein. A major drawback of these cell lines is their inefficient energy metabolism because they lack the enzymatic link between the two pathways glycolysis and TCA cycle. Thus, the toxic metabolites lactate and ammonia that impair cell growth and productivity are secreted into the culture supernatant. In order to improve the energy metabolism a cytosolic pyruvate carboxylase (PYC2) from Saccharomyces cerevisiae was introduced into the cell line CHO DG44 that is at present one of the most important industrially used production cell lines. The effect of PYC2 on the energy metabolism and the productivity of CHO DG44 was investigated. Successful expression of PYC2 could be demonstrated by proving enzyme activity. In contrast to other cell lines, the additional possibility to oxidize glucose could not significantly improve the growth behavior of CHO DG44. To achieve optimization of the productivity of CHO DG44 a dicistronic plasmid containing the genes for the model protein Human Growth Hormone (HGH) and PYC2 was constructed. CHO DG44 was cotransfected with this plasmid and the dihydrofolate reductase gene, and the HGH and PYC2 genes were co-amplified. PYC2 activity could not be detected in CHO DG44. With this approach neither the energy metabolism nor the productivity of CHO DG44 could be improved